肝硬化患者外周血IP10及其mRNA表达与血清转氨酶水平关系

1、肝硬化患者外周血IP10及其mRNA表达与血清转氨酶水平关系         11-01-31 13:45:00     编辑：studa20               作者：王平平, 高凤兰, 王健, 项桂菊, 胡孝彬【摘要】  目的: 探讨肝硬化患者外周血IP10、 IP10 mRNA的表达及其与转氨酶水平的关系。方法:

2、筛选典型HBV感染后肝硬化患者, 以ELISA法检测患者血清IP10水平; Realtime PCR检测IP10 mRNA含量, 以lg cDNA/lg GAPDH代表其mRNA水平。结果: 肝硬化患者血清IP10及PBMC中IP10 mRNA水平分别为(299.3±77.2) ng/L、 0.7479±0.1495, 与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05, P<0.01); ALT、 AST升高组外周血IP10及其mRNA升高, 与转氨酶正常组相比差异有统计学意义(P<0.05, P<0.01)。升高组中 IP10与ALT、 AST及ALT/

3、AST比值存在相关(r=0.6284, 0.7162, 0.6970, P<0.01)。结论: 肝硬化患者外周血IP10及其mRNA表达增高, 与肝细胞损伤程度密切相关, 在介导肝炎后肝硬化进展中起重要作用。 【关键词】  肝硬化 IP 10 mRNA PCR 外周血 转氨酶肝硬化是肝脏纤维结缔组织弥漫性增生伴有肝细胞结节状再生, 是肝细胞在多因素作用下反复损伤的慢性病理过程。IFN诱生蛋白10(interferon inducible protein 10, IP10)是1985年Luster等用IFN刺激U937细胞株, 从cDNA基因库中筛选出, 属CXC家族ELR亚族,

4、 可由IFN、 LPS等诱导产生, 介导Th1型炎症反应, 抑制血管新生及肿瘤生长。丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)与天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)及其AST/ALT比值能判断肝病进展及肝病预后的较好指标1。为了解IP10与血清转氨酶水平关系及其在肝硬化发病机制中的作用, 筛选39例慢性乙肝后肝硬化患者, 探讨其外周血IP10及其mRNA水平, 现将结果报道如下。1  材料和方法1.1  材料  FicollHypaque分离液购自上海试剂二厂; HBVDNA诊断试

5、剂购自上海中亚基因研究所; ELISA法IP10试剂盒购自法国DLACLONE公司; TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司; cDNA合成试剂购自上海申能博采生物科技有限公司; 半自动生化仪ECOMF6124购自德国Eppendorf公司; EXL808全自动酶标仪和EXL50X全自动洗板机购自美国BioTek公司; LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green购自德国Roche公司; iCycle荧光实时定量PCR仪购自美国BioRad公司。1.2  检测对象  39例肝硬化患者为2006-01/2007-05我校教学

6、医院收治的患者。其中男27例, 女12例, 年龄31.262.5岁, 平均44.5岁, ALT升高者18例, AST升高者24例, AST/ALT>1.0者27例; 入选患者均为HBV感染者,  临床诊断符合2005年全国病毒性肝炎会议修订诊断标准, 病程均超过6个月, 无合并HAV、 HCV、 HDV、 HEV、 HIV感染的实验室依据, 无其他自身免疫性疾病, 3个月内未系统使用抗病毒和免疫抑制剂治疗。另选25例本市中心血站体检正常献血员为对照组, 其中男16例, 女9例,   年龄20.342.9岁, 平均32.0岁。1.3  方法1.3.1

7、  标本采集  分批采取患者晨起空腹静脉血5 mL, 分别置2支含肝素的无菌Eppendorf管和2支灭菌普通管。肝素抗凝血以FicollHypaque常规分离外周血单个核细胞(PBMC), 普通管常规分离血清备检。1.3.2  血清IP10检测  采用ELISA以试剂盒提供标准品绘制标准曲线, 每批检测设空白、 阴性、 阳性对照各2孔, 取100 L待测血清和100 L辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗趋化因子单克隆抗体(mAb), 加至包被有趋化因子mAb的酶标反应板孔内, 37孵育1 h, PBS缓冲液洗涤5次, 加100 L底物33甲基苯并噻唑啉6

8、磺酸盐, 室温30 min, 加2 mol/L H2SO4终止反应, 在EXL808全自动酶标分析仪上(450±2) nm处读取A值, 每孔测定2次, 取均值, 依标准曲线确定血清IP10含量。IP10最低检测水平<2 ng/L, 且批内和批间变异系数分别为<5%和<7%。1.3.3  IP10 mRNA检测  采用Realtime PCR法。将分离的PBMC以RPMI1640培养液调整细胞数至(12)×109个/L悬液; 以TRIzol试剂抽提PBMC总RNA, 并逆转录为cDNA, 置-86冰箱备检。以SYBR Green荧光标记法

9、检测PCR产物, 总反应体系25 L, 包括上下游引物各10 pmol, MgCl2 2.5 mmol/L, ExTaq 1.25 U, dNTP 2 mmol/L, 1×PCR buffer (500 mmol/L KCl, 100 mmol/L Tris, 20 g/L gelatin, pH8.3), 2×SYBRTM Green液, 2 L标准品或模板cDNA(15稀释)。趋化因子引物设计参照Hirata等方法进行2, 3, IP10引物序列和扩增片段长度见表1。PCR扩增参数如下: 95预变性300 s, 然后95 50 s, 55 40 s, 72 90 s共3

10、5个循环, 最后72延伸300 s。以甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)为内对照, 以lg cDNA/lg GAPDH比值代表其mRNA水平。表1  HBV及IP10引物序列和扩增片段长度（略）1.3.4  标准品和标准曲线制备  以GAPDH为参照标准, 为确定定量扩增的效率和灵敏度, 将起始浓度为(106 copies/L)的GAPDH, 按110设6个梯度浓度, 即106 copies/L、 105 copies/L、 104 copies/L、 103 copies/L和102 copies/L、 0。1.4  统计学处理  IP10及其

11、mRNA水平以x±s表示; 采用SPSS11.5软件进行t检验及相关分析, P<0.05有统计学意义。2  结果2.1  不同转氨酶水平患者IP10表达  RTPCR显示肝硬化患者IP10表达(图1),  ELISA及Realtime PCR显示患者外周血IP10及其mRNA水平升高(P<0.05或P<0.01,  图2), 依ALT、 AST水平将患者分为ALT、 AST正常组、 升高组, ALT、 AST升高组及AST/ALT>1.0组外周血IP10及其mRNA水平高于转氨酶正常组, 差异亦有统计学意义(P

12、<0.05或P<0.01, 图2)。图1  PBMC中IP10表达（略）1, 3, 5: GAPDH; 2, 4, 6: IP10; 1, 2: 对照组; 3, 4: 患者1（转氨酶正常）; 5, 6: 患者2（转氨酶升高）.图2  IP10及其mRNA与转氨酶关系（略）aP<0.05, bP<0.01 vs 对照组或相应正常组.2.2  IP10表达与转氨酶水平关系  ALT升高组患者血清IP10水平与ALT相关(r=0.6284, P<0.01, 图3), AST升高组血清IP10水平与AST明显相关(r=0.7162,

13、 P<0.01, 图4), AST/ALT比值升高组血清IP10水平与AST/ALT比值亦明显相关(r=0.6970, P<0.01, 图5)。图3  血清IP10水平与ALT相关性（略）图4  血清IP10水平与AST相关性（略）图5  血清IP10水平与AST/ALT相关性（略）3  讨论    IP10为CXC家族ELR-趋化因子, 对表达CXCR3受体的T淋巴细胞、 单核细胞等产生趋化游走。本研究结果显示, HBV感染后肝硬化患者外周血IP10及其mRNA水平增高, 与对照组相比, 差异有统计学意义(P&

14、lt;0.01); PBMC内IP10 mRNA与血清IP10蛋白水平具有一致性, 提示 PBMC内IP10 mRNA可能是导致血清IP10水平升高的重要原因。Chuang等4研究显示IP10在原发性胆汁性肝硬变患者血浆中明显升高, 且和病情的严重程度相关。赵金红等5研究表明IP10在慢性乙肝中表达升高, 介导炎症反应, 参与乙型肝炎慢性化。HBV感染后肝硬化患者体内IP10表达增高可能的原因为: 肝硬化患者存在一定程度的免疫功能紊乱, 肝清除能力下降, 内毒素生成增加, IL1和TNF生成, TNF、 IL1、 和IFN通过IFN调节因子家族P48和2个STAT1形成命名为IFN激活因子3的

15、三聚体, 与IFN刺激元件(ISRE)结合后, 从而驱动IP10 mRNA表达6。肝硬化进程中,随着肝细胞的逐渐坏死, 胶原合成及胶原沉积不断增加, 在肝细胞炎性改变的基础上纤维化程度逐渐加重, 血清IP10水平升高。肝硬化患者常伴有不同程度的门脉高压、 一定程度胃肠道菌群失调、 肠黏膜缺血缺氧, G-菌及其产物LPS等经破损黏膜入血, IP10分泌增加。肝硬化患者全身高动力循环状态, 门脉高压, IP10可维持血管稳态, 可能作为免疫抑制剂, 发挥潜在的抗肿瘤作用。        本实验结果显示, 肝硬化患者血清IP10含

16、量与ALT水平呈正相关, 表明IP10水平在一定程度上反应肝硬化的炎症活动状况, 对了解肝硬化的进展有重要意义。HBV感染的肝细胞损伤主要来自宿主的免疫应答7, 机体内免疫复合物增加, 刺激机体产生大量TNF、 IL6等前炎症因子, 这些因子本身可诱使肝脏微循环障碍, 血液通透性增加, 全身高动力循环, 肝细胞水肿变性, 继而坏死, ALT大量释放入血, IP10表达增强。王健等8, 9研究发现在慢性乙肝及丙型肝炎中IP10表达水平升高且和ALT表达水平呈正相关, 参与肝炎的慢性化进程。同时血清内IP10含量与AST水平呈正相关。一般情况下, AST升高幅度不及ALT, 随着HBV的感染持续, 肝硬化程度加重, 机体内毒素水平升高, 可直接杀伤正常和HBV感染肝细胞, 引起肝细胞黄疸, 血清胆红素升高, 形成肝脏炎症损害, 使IP10活性增加。Nishioji等10研究表明慢性乙肝中血清IP10水平较正常对照组明显升高,