柑桔黄龙病诊断技术研究进展

1、柑桔黄龙病诊断技术研究进展广东农业科学2008年第6期柑桔黄龙病诊断技术研究进展王爱民.邓晓玲(1.广州市农业标准与监测中心,广东广州510315;2.华南农业大学资源环境学院,广东广州510642)摘要:柑桔黄龙病是一种毁灭性病害,介绍了柑桔黄龙病的诊断发展过程,具体包括柑桔黄龙病的症状诊断法,指示植物诊断法,生化指标鉴定法,电镜观察法,血清学诊断法,DNA探针杂交法以及PCR扩增法等技术.关键词:柑桔;黄龙病;诊断技术中图分类号:$436.661.1文献标识码:A文章编号:1004-874X(2008)06010103柑桔黄龙病(citrushuanglongbing.HLB)是柑桔生产的

2、毁灭性病害,最早在我国广东省潮汕地区发现.1995年前,该病在不同国家和地区有不同的名称,在我国大陆称为黄龙病或黄梢病(yellowshootdisease).在南非称为青果病(greening),在印度称为顶梢枯死病(dieback),在菲律宾称为叶斑病(1eafmottle),在印度尼西亚称为叶脉韧皮部恶化病(veinphloemdegeneration).而国际上一般称之为柑桔青果病(citrusgreening).直到1995年,在第l3屑国际柑桔病毒学家会议(internationalorganizationofcitrusvirologists,IOCV)上,为纪念我国植物病理学家

3、林孔湘教授首次证实该病害是一种传染性病害的原创性T作,决定以柑桔黄龙病作为该病害的正式学名,并确认了我国科学家对这种世界性重要病害研究所作出的卓越贡献.迄今为止,柑桔黄龙病已在亚洲,非洲,美洲的40多个国家和地区发生流行21.柑桔黄龙病的症状非常复杂,在不同生长季节可以表现不同的症状类型31.大多数人认为柑桔黄龙病由局限于韧皮部筛管细胞内的革兰氏阴性细菌所引起141,该病菌归属于原核生物,薄壁菌门,变形菌纲,仅一亚纲的韧皮部杆菌属.目前柑桔黄龙病菌共发现3个种:亚洲种(CandidatusLiberibacterasiaticus.Las).主要分布在亚洲国家和美国佛罗里达州.在巴西圣保罗州,

4、毛里求斯,留尼旺岛也发现小部分黄龙病菌属于亚洲种;非洲种(CandidatusLiberibacterafrieanus,Laf),主要分布在非洲国家:美洲种(CandidatusLiberibacteramericus,Lam),主要分布在巴西圣保罗地区【3_51.柑桔黄龙病菌的远距离传播主要依靠带病苗木和接穗的调运,田间收稿日期:20o80319基金项目:广东省自然科学基金项目(06025850);农业部农作物病虫害疫情监测与防治项目(4200一C07041)作者简介:王爱民(1965一),男,硕士,农艺师通讯作者:邓晓玲(1966一),女,硕十,副教授,Email:xldengsacu.

5、edu.ca101近距离传播主要依靠柑桔木虱【.目前还没有发现抗病品种和特效药剂,因此,防治柑桔黄龙病必须采取综合的防治措施才能取得良好的效果.我国很多研究者为防治柑桔黄龙病作出了很大努力并取得了卓有成效的成果8-9.目前.对柑桔黄龙病的诊断主要有症状诊断,指示植物鉴定,电镜观察,生化指标鉴定,血清学诊断,DNA探针杂交以及PCR扩增技术等方法,现对各种诊断方法简介如下.供广大柑桔种植者参考.1症状诊断长期以来对柑桔黄龙病主要是根据田间症状来进行诊断:(1)柑桔植株刚开始发病时,顶部有1枝或数枝新梢的叶片停止转绿,表现为树冠顶部枝梢黄化,即出现"黄梢"(2)出现特异的斑驳型

6、黄化症状,主要表现为由叶脉基部和侧脉附近开始黄化,逐渐扩大形成黄,绿相间的不对称斑驳状.斑块形状和大小不一;(3)桔类植株感染黄龙病在成熟期常表现为果蒂部深红色,俗称"红鼻子果".柑桔黄龙病的症状有一定的特异性,具有诊断价值.目前,主要选择每次新梢的成熟期.特别是在每年l0l2月秋梢成熟以后,根据当年春梢叶片的斑驳症状来诊断田间的黄龙病病树.但是.柑桔黄龙病症状发展过程会受到环境条件的影响,例如果园管理不良,缺乏营养或其他病虫害混合危害时也有类似症状,而已经感染黄龙病但尚未表现明显症状的植株难以依据症状作出准确的诊断.因此,症状诊断在必要时要与其他诊断方法相结厶【Ol.2指

7、示植物鉴定柑桔黄龙病的早期诊断是将可疑的枝条嫁接到容易感病的指示植物上,接种34个月后观察其发病情况.不同地区使用的指示寄主不同,如南非用伏令夏(Valencia)tlIj,印度用Kagzi株檬(C.aurantifolia)作为黄龙病的指示植物【,而我国多用桠柑作为黄龙病的102指示植物_3】.虽然指示植物嫁接鉴定比田间诊断准确,但周期太长,不利于快速检测.3电镜观察自1970年Lafleche等I13】用电镜观察到黄龙病菌以来,电镜观察一直作为柑桔黄龙病重要的鉴定和诊断手段.在电镜下.根据黄龙病菌的形态,大小及菌体壁膜结构等特征可以作出正确的诊断.但由于柑桔树体内的黄龙病菌浓度较低,且分布

8、不均匀,电镜制样材料较小以及需具备电镜器材,使得电镜诊断法在生产中很难推广应用4生化指标鉴定20世纪80年代中期,我围采用荧光显微镜检测法对黄龙病进行诊断.发现感病韧皮部呈现黄色荧光,而健康植株,病毒侵染或缺素症状组织中没有黄色荧光.此法在发病初期检测有效,但是特异性不强.后来采用感病植株的生化指标进行诊断,其原理是利用感病植株韧皮部特有的荧光物质龙胆葡糖苷作为指示物质,感病组织可在365nm波长下观察到亮蓝紫色斑点14I5血清学诊断由于黄龙病菌目前还不能进行人工培养,不能获得病菌纯培养,因此要制备高效的黄龙病菌单克隆抗体比较困难.柯穗等(1986)研究报道利用菟丝子可以成功地将黄龙病病原体从

9、柑桔转移到草本植物长春花上,病原体能够更好地繁殖和生长;以长春花病株的叶脉为材料,采用酶解,差速离心和Percoll梯度离心方法,可以获得完整菌体的粗提纯物,这些粗提物可用于改进的血清免疫方法20世纪80年代,法国建立了针对印度浦那和非洲黄龙病菌的单克隆抗体HLB血清学检测方法.可以分别鉴别来自印度,菲律宾,留尼汪岛等的黄龙病样品,但不能鉴别来自中国的样品.单克隆抗体凶专一性过强,难以应用于不同地域的黄龙病菌变异菌株,可能会发生漏检,因此,单抗的应用受到很大的限制6核酸探针检测核酸分子杂交的原理是:在一定的条件下,具有一定同源性的2条核酸单链按碱基互补原则退火形成双链;杂交双方是待测核酸和标记

10、探针,常选用的标记物是放射性同位素或非放射性物质如生物素等,杂交后通过标记探针放射自显影或尼龙膜显影就可达到检测的目的.该技术的优点是检测快速专一,灵敏度高达纳克级.Villeehanoux等【16首次利用DNA探针检测柑桔黄龙病,制备的探针只能检测出亚洲种黄龙病而不能检测出非洲种.Hocquellet等成功获得2个用DIG标记的非放射性探针ln一2.6和AS一1.7,可分别检测亚洲种和非洲种黄龙病菌.在国内,也有研究采用DIG对克隆的黄龙病菌DNA片断进行标记,制备非放射性探针检测黄龙病菌.但分子探针杂交过程复杂,DNA用量大等凶素限制了该技术的广泛应用18j.7PCR检测技术随着分子生物学

11、技术的迅速发展,细菌的检测技术也进入了分子生物学时代,许多新技术和新方法在细菌研究中得到广泛应用.Jagoueix等ll9J利用细菌的通用引物扩增得到黄龙病菌的16SrDNA序列,据此序列设it-特异引物OI1/OI2c,并通过常规PCR对亚洲种和非洲种的柑桔黄龙病菌进行扩增,得到的特异性片断长度均为1167bp;采用限制性内切酶Xbal酶切PCR产物,非洲种的PCR产物被酶切为3条片断(520,506,130bp),亚洲种的PCR产物被酶切为2条片断(640,520bp),根据酶切产物的不同可以区分亚洲种和非洲种柑桔黄龙病菌.但011/012c不能扩增美洲种柑桔黄龙病菌,要鉴定美洲种黄龙病菌

12、,国际细菌命名委员会规定采用特异引物GBI/GB31.Hocquellet等(1999)根据柑桔黄龙病菌B一操纵子核糖体蛋白基因(rp/KAJLrpoBC)设计特异引物A2/J5对亚洲种和非洲种的柑桔黄龙病菌进行扩增,亚洲种的PCR产物长度为703bp,非洲种的PCR产物长度为669bp,根据PCR产物长度的不同可区分亚洲种和非洲种柑桔黄龙病菌.由于PCR技术的应用,使得黄龙病菌的检测技术得到飞速发展,在常规PCR基础上衍生发展了灵敏度更高,特异性更强的巢式PCR技术(NestedpolymerasechainreactionNestedPCR).该方法是利用2套PCR引物进行2轮PCR扩增反

13、应,在第1轮扩增中.外套引物用以产生扩增产物,扩增所得产物在内嵌引物的存在下进行第2轮扩增.由于巢式PCR反应有2次PCR扩增.因此,虽然增加了扩增反应的复杂性但降低了扩增多个靶位点的可能性,增加r检测的特异性.Harakava等201研究发现巢式PCR检测的灵敏度比常规PCR有所提高.李韬等【2Ij应用巢式PCR检测柑桔木虱及九里香上的黄龙病带菌率,结果发现常规PCR只可检测到最低2头带菌术虱,巢式PCR可检测到单头带菌木虱,说明巢式PCR比常规PCR灵敏.应用巢式PCR能有效提高检测的灵敏度,但也要注意避免假阳性的出现.为了克服常规PCR和巢式PCR不能准确定量,容易交叉污染和容易产生假阳

14、性等问题,逐渐发展了实时荧光定量PCR(realtimetuorescentquantitativePCR)技术.realtimePCR技术融合了PCR和DNA探针杂交技术,在PCR反应体系中加入荧光基团.利用荧光信号累积实时监测整个PCR过程.最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析.该技术作为核酸定量的手段,以高灵敏性,高特异性,高精确度,实时性,少污染等优点,实现了PCR从定性到定量的飞跃.在植物病原物检测中得到广泛的应用.廖晓兰等【22设计HLBprobe作为特异性探针,在国内首次建立了柑桔黄龙病病原实时荧光定量PCR检测体系.其检测灵敏度比常规PCR高100倍.胡浩等1231用TaqM

15、an探针法和SYBRGreenI荧光染料法建立了2种实时荧光定量PCR反应体系,实时荧光定量PCR方法稳定性好,污染少,操作简便,是准确,灵敏,快速甄别柑桔黄龙病病原菌近缘种的检验检疫技术.Li等I24对亚洲种,非洲种,美洲种柑桔黄龙病菌分别设计特异引物和特异探针,利用常规PCR和realtimePCRTaqMan探针法对柑桔黄龙病病原菌进行特异性扩增,发现0.02mg的叶片中脉都能检测到黄龙病病原.对比发现realtimePCR比常规PCR灵敏度更高,特异性更强,重复性更好,是柑桔黄龙病早期病害诊断的有效手段参考文献:1】ReinkingOA.Diseasesofeconomicplants

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