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文档简介

1、威榕拉斯生物技术(北京)右限公诃质粒大量提取纯化试剂盒(Plasmid Maxprep Kit)产品说明:本试剂盒用碱裂解法从培养閑中提取质粒DNA,采用全新技术,通过儿次离心去除 蛋白质、多糖、内毒索、RNA等杂质,获得岛质呈的质粒DNA。纯化DNA的OD260/280 通常在1.9左右,可直接应川丁细胞转染II至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的 丁作中。纯化过程均任Eppendorf?中操作,方法简也 不需特殊设条,无需过柱, 不用酚氯仿抽提:无论细菌裂解释放出的质粒fr:lmg以下还是/klOmg以上,难本都可 完全冋收,不必担心质粒DNA的丢失。本方法提取纯化质粒DNA,对质粒损伤

2、小, 即使是lOkb真至lOOkb以.上的人熨质粒或超人型质粒,只耍碱裂解法能够提取,就町 以有效纯化。纯化过程约需1.52小时。产品内容与储存方法:名称数量保#Buffer I (重悬液)110 mlRTBuffer II (裂解液)100 mlRTBuffer HI (中和液)100 mlRTBufferIV (杂质淸除液A)4 ml4*CBuffer V (杂质淸除液B)1.4 mlRTBuffer VI (杂质淸除液C)4 ml代RNase A ( 20 mg ml)0.5 ml20C试剂盒可作20次(vl50ml苗液/次)质粒提取纯化。常温运输。RNase A于2(TC保仏 首次使用

3、时加入Buffer I中混匀,置4°C保存。Buffer IV与Buffer VT遂4°C保存,其余溶 液保存于室温。有效期6个月。Buffer II和Buffer V“J能会仃沉淀产生。请并在37'C水浴和5(TC水浴加热溶解,然后混 匀使用。Buffer IV如有分层,混匀即可使用。所需其它试剂:使川者需准备TE (Tris-HCl 10 mM. EDTA 1 mM. pH &0,超纯水配制,高爪或过滤火 菌),异丙醇和70%乙醇(超纯水与无水乙醇配制)。操作方法:质粒提取1)取过夜培养菌150ml曲液,装入介适的离心瓶中,4,500-6.000xg J

4、-4-C离心10mm沉淀菌体,完全弃除上淸。2)加A5 ml Buffer L充分混恳震荡閑体沉淀,使其完全分散开,至无絮块心在。细菌悬液移入50 ml离心管中。3)1JIIA5 ml Buffer轻轻颌倒离心管68次,室温放迓5 mm,使细侗完全裂解,溶电话:(010) 58941231, (010) 58941232传頁:(010) 58941232网址:vx-电 /邮件:iuiion cn威格拉斯生物技术(北京)有限公诃液透明。4)加入5 ml Buffer III,立即颠倒离心省,68次,允分混匀,至白色絮状物产生。冰上 放置 10T5 min*5)上述裂解液T4-C 12,000-1

5、6.000 xg离心15 min,小心吸出上淸,移入新的50 ml离 心管中。6)加入10ml ft丙醇,颇倒离心伍;,充分混匀。冰上放置10-15 min.,7)F4*C 12.000-16,000 xg离心10 min,小心弃去上淸,倒置轻轻沥干残余液体,加入 0.5 ml Buffer I.完全溶解沉淀团块(可用宽LI吸管轻轻吹打辅助溶解)。移入新 的1.5 ml离心管中,室温放置10、20min°8)质粒粗提物用台式离心机室温高速离心2mm,上淸移入新的15 ml离心管中.质粒纯化:1)0.5 ml丿贡村粗提液屮加入100山Buffer IV(杂质消除液A),轻轻混匀,12.

6、000 x g 离心2min,将上涓液转移至新的离心管中。2)再加入lOOglBufErlV (杂质淸除液A),轻轻混匀,12,000xg离心5mm,将上淸 液转移至新的离心管中。3)加入70山Buffer V (杂质淸除液B),轻轻混匀,12.000 x g离心5 min,将上淸液 转移至新的离心管中。4)加入0.5 ml异丙醉,混匀,室温放置10 min。12.000 x g宅温离心10 mm,弃去上淸 液.用70%乙醉lml轻轻洗涤,弃去液体,室温倒置凉干5 mm.,5)0.5mlTE溶解沉淀(可在37°C水浴中振荡或用宽I吸筲轻轻吹打辅助溶解)6)加A200 id Buffe

7、r (杂质淸除液C),混匀后冰上放置10-30 min, 12,000 xg宅温 离心10min弃去上淸液,轻轻加入lml70%乙醉洗涤两次,韦温倒置凉干5-10mm 使乙醇完全蒸发。7)加适戢TE (200-5001)溶解沉淀(可在37°C水浴中振荡以辅助溶解)。注意事项:1)从人虽的苗液或菌体提取质粒时,町按比例捉為Buffer I、Buffer nfllBuffer ID的用 量,以充分裂解菌体,提髙质粒的回收量和纯度.2)提取步骤7和纯化步骤5中,充分溶解沉淀对提高质粒产量和纯度非常重耍。3)操作中耍动作轻柔,防止机械剪切可能对DNA的损欠。4)可在纯化的孑个步骤询后留取数微升的DNA溶液,以后电沐鉴立比较提取和纯化 结果。5)纯化步骤3和6离心后,可能看不到明显沉淀。如在步骤6未见沉淀,担心DNAi失 ,可保留上淸液,待完成全部操作后电泳鉴定,以确定是否获得终产物(数方微 克鬲纯度的质粒DNA离心后沉淀在管的恻瞇上,可能无法看到明显团块)。6)

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