浅论热休克蛋白27参与兔肺缺血预处理保护

1、浅论热休克蛋白27参与兔肺缺血预处理保护                  作者：涂军伟，徐正 王万铁，吴成云，方舟溪【摘要】  目的:探讨热休克蛋白27（HSP27）在肺缺血预处理保护中所起的作用及意义。方法：采用在体兔单肺原位缺血再灌注模型，30只日本大耳兔随机均分为三组：假手术（S）组、缺血/再灌注（I/R）组及缺血预处理（PC）组，实验检测肺组织湿干重比和肺泡损伤数比值，电镜评定肺组织超微结构损伤，免疫组化检测肺组织热

2、休克蛋白27的定位及表达。结果：I/R组肺组织湿干重比（W/D）及肺泡损伤数比值(IAR)明显于组（均P0.01）；PC组W/D及IAR均显着低于I/R组（P0.05或P0.01）。免疫组化显示PC组肺小动脉内膜及外膜层、肺小静脉壁全层、远端呼吸性细支气管及少许肺泡上皮HSP27有强表达；肺小静脉HSP27含量（平均吸光度值LD）高于I/R组和组（均P0.01）。I/R组肺组织超微结构的损伤明显，而PC组损伤明显减轻。结论 ：肺缺血预处理能减轻肺缺血再灌注损伤，HSP27表达增加并参与肺缺血预处理保护。 【关键词】  热休克蛋白；兔；缺血预处理；缺血再灌注损伤  

3、 Abstract:  Objective: To investigate the effect and significance of heat shock protein-27 in the  protection afforded by lung ischemic preconditioning in rabbits. Methods: Single lung in situ ischemic reperfusion animal model was used. 30 rabbits were randomly divided into three groups: s

4、ham (S) group， ischemic/reperfusion (I/R) group and ischemic preconditioning (PC) group. Wet to dry ratio (W/D) and injured alveoli rate (IAR) were determined. Ultramicroscopic structural change was observed under electron microscope. Heat shock protein-27 was detected with immunohistochemistry. Res

5、ults:W/D and IAR in I/R group were higher than that in S group （P0.01）. The W/D and IAR in PC group were lower than that in I/R group (P0.05， P0.01 respectively). The heat shock protein-27 strongly expressed in intima and extima of small pulmonary artery，vessel wall of small pulmonary vein， respirat

6、ory brochiole and part of alveolar epithelium. The light density of heat shock protein-27 in small pulmonary veins in PC group was higher than that of other groups. Electron microscope showed serious lung injury occurred in I/R group while there was no significant injury in PC group. Conclusion: Lun

7、g ischemic preconditioning can mitigate lung ischemia reperfusion injury，highly expressed heat shock protein-27 participated in the protection afforded by lung ischemic preconditioning.   Key words:  heat shock protein；rabbit；ischemic preconditioning；ischemia reperfusion injury &

8、#160; 热休克蛋白（HSP）是一组结构上高度保守的多肽，能改变或修饰其他蛋白质，通过影响或调节其他功能性蛋白而间接发挥作用。近年有人发现肺缺血预处理能保护肺缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤1-3，但HSP27是否参与缺血预处理保护鲜见报道。本实验复制兔单肺原位I/R模型观察缺血预处理对肺缺血/再灌注损伤的干预，检测肺缺血预处理后HSP27在肺组织的定位、表达及其变化，探讨HSP27在肺缺血预处理保护中的作用。   1  材料和方法   1.1  模型复制  雄性日本大白耳兔30只，体重

9、2.02.5 kg，温州医学院实验动物中心提供。经耳缘静脉注射20%乌拉坦（5 mg/kg）麻醉，气管切开插管接动物呼吸机，吸纯氧，通气频率为3040 次/min，潮气量双侧肺通气1520 ml/kg，单侧肺通气810 ml/kg，呼吸比1:1.25。实验中予生理盐水维持输液，左胸第4及第5肋间开胸，左肺门游离后留置阻断带，静脉注射肝素抗凝。按Sekido等方法复制在体兔肺I/R模型，即完全阻断左肺门血管和支气管一定时间后恢复其血供和通气。   1.2  实验分组  动物随机分三组。假手术组（S组，n =10）：左肺门游离后留置阻断带，但不进行阻断，观察

10、150 min。缺血再灌注组(I/R组，n =10)：留置阻断带后观察30 min，继而阻断左肺门60 min后开放再灌注60 min。缺血预处理组（PC组，n =10）：留置阻断带观察5 min，阻断左肺门10 min后开放，续再灌注15 min（即缺血预处理），以后操作同I/R组。   1.3  肺组织湿干重比测定  实验末取2 g左右左下肺组织称重为湿重，70 烘箱烤24 h后称重为干重，计算出湿干重比（W/D）。   1.4  肺泡损伤数比值测定  左肺组织多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，每个标本

11、5张切片，任取1张，光镜下观察1015个视野（200倍）的肺泡总数，根据Murata等方法计算肺泡损伤数，即肺泡中细胞总数（红细胞或白细胞）超过2个以上视为肺损伤，损伤的肺泡数与总的肺泡计数的比值为肺泡损伤数比值(IAR)。   1.5  HSP27的免疫组织化学检测  采用SABC法（兔抗HSP27多克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG、SABC试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司）。4%多聚甲醛固定的肺组织石蜡切片，3%过氧化氢室温处理10 min后，加正常山羊血清封闭，滴加一抗（1:50稀释）、二抗、SABC、DAB显色，阳性结果呈棕黄色。选取每只兔肺

12、组织切片直径约25150m之肺小静脉5支，用免疫组化图像分析仪软件（华东理工大学研制）测取肺小静脉管壁平均吸光度值（LD）作为HSP27的相对含量。   1.6  肺组织电镜检查  实验末，每组取4例，在肺门横切面取1 mm×1 mm×1 mm大小肺组织23块，2.5%戊二醛预固定，1%锇酸后固定，常规脱水，包埋，超薄切片，常规染色，H-600型透射电镜观察。   1.7  统计学处理方法  多组样本均数比较进行方差齐性检验，采用单因素方差分析，两两比较采用q检验LSD法。  

13、;           2  结果   2.1  各组肺组织湿干重比及肺泡损伤数比值的变化  表1显示，I/R组W/D及IAR明显高于S组（P 0.01）；PC组W/D及IAR与S组比较差异无显着性（P 0.05），但均低于I/R组（P 0.05或P 0.01）。   2.2  HSP27的免疫组化检测  S及I/R组近端支气管上皮及平滑肌有少量HSP27表达，肺小动脉及肺小静脉各层表达不明显。PC组肺小动脉内膜及外

14、膜层、肺小静脉壁全层、远端呼吸性细支气管及少许肺泡上皮有较强表达（见图1），S组及I/R组上述部位无明显表达（见图1及图1）。PC组肺小静脉管壁HSP27LD为0.174±0.022，I/R组肺小静脉管壁HSP27 LD为0.128±0.017，组肺小静脉管壁LD为0.121±0.011，经检验PC组肺小静脉管壁HSP27LD明显高于I/R组和组（均P 0.01）。   2.3  肺组织超微结构  电镜下，PC组和S组肺组织超微结构损伤不明显（图2、图2）。I/R组肺组织表现出明显的损伤性改变，表现为肺细小动脉基底膜肿胀模糊

15、，厚薄不均，基底部变窄，甚至断裂，内皮细胞线粒体肿胀（图2），部分内皮细胞呈拱桥状或高柱状向腔内突出，有脱落。肺细小静脉基底膜有断裂，不完整。毛细血管管腔可见多量中性粒细胞附壁现象，部分堵塞管腔。毛细血管内皮细胞吞饮小泡增多，线粒体肿胀，内皮连续性中断。   3  讨论    HSP27属低分子量热休克蛋白家庭成员，主要参与微丝的稳定和细胞信号转导，是机体内源性保护机制的重要成员之一。HSP27能阻止应激状态下肌动蛋白和微丝的分裂，有利于细胞骨架的稳定，它不仅对单个细胞产生应激耐受起重要作用，而且通过内皮和上皮的屏障作用，对整个机体起保护作用。

16、   本实验显示，缺血再灌注损伤使肺组织湿干重比增加，肺泡损伤数比值增大，电镜下肺毛细血管的内皮细胞可见不同程度的超微结构损伤；缺血预处理干预后，肺组织损伤明显减轻，同时发现PC组HSP27较强表达在肺小动脉内膜及外膜层、肺小静脉壁全层、远端呼吸性细支气管及少许肺泡上皮，而组和I/R组上述部位HSP27均无明显表达；因而推测缺血预处理后肺缺血再灌注损伤减轻与HSP27在上述部位表达增加并发挥其分子伴侣的保护功能有关。Hout等报道，培养中华仓鼠肺细胞株CCL39过程中发现诱导细胞表达增加HSP27能使微丝稳定，防止氧化损伤。心肌的缺血预处理保护始于心肌的反复短暂缺血，且有研

17、究发现，HSP27参与心肌缺血再灌注损伤的保护，多与其磷酸化形式有关7-8。在非心肌组织中，HSP27大多是以非磷酸化形式存在，故本实验单次的肺缺血预处理即能使肺组织非磷酸化形式的HSP27表达增加，并减轻肺缺血再灌注损伤，似乎可以认为其作为终末效应子介导了肺缺血预处理保护，至于肺缺血预处理后瞬间HSP27高表达的机制及后继缺血再灌注损伤对其的影响仍需进一步研究。【参考文献】  1 Soncul H, Oz E, Kalaycioglu S. Role of ischemic precondi-tioning on ischemia-reperfusion injury of the

18、 lungJ. Chest,1999,115(6):1672-1677.李国虎, 陈胜喜, 鲁尔雄,等. 缺血预处理减轻在体肺缺血再灌注损伤J.湖南医科大学学报,1999,24(4):319-321.涂军伟, 徐正衸, 王万铁,等. 蛋白激酶C在兔肺缺血预处理保护中的作用J.温州医学院学报,2003,33(2):89-91.Sekido N, Mukaida N, Harada A, et al. Prevention of lungreperfusion injury in rabbits by a monoclonal antibody againstinterleukin-8J.Natu

19、re,1993,365(6447):654-657.Murata T, Nakazawa H, Mori I, et al. Reperfusion afteratwo-hour period of pulmonary artery occlusion causes pul-monary necrosisJ. Am Rev Respir Dis, 1992, 146(4):1048-1053.Huot J, Houle F, Spitz DR, et al. HSP27 phosphorylation-mediated resistance against actin fragmentation and celldeath induce