灭活柯萨奇B1　病毒在原代培养骨骼肌细胞中促进基因转移的研究

1、    灭活柯萨奇B1病毒在原代培养骨骼肌细胞中 促进基因转移的研究        【摘要】目的研究灭活后的柯萨奇病毒B1(Coxsakie virus B1,CVB1)在原代培养骨骼肌细胞中，对报道基因pCDNA3-LacZ转移效率的影响。方法用聚乙二醇沉淀和蔗糖低温超速离心法提纯并用-丙内酯灭活病毒，将灭活CVB1、转铁蛋白聚赖氨酸(TfpL)和报道基因设计成不同浓度组合，观察肌肉细胞中-半乳糖苷酶染色阳性的细胞数。结果灭活CVB1+TfpL+LacZ在肌肉细胞

2、中使基因转移效率由TfpL+LacZ组的不到1%提高到15%20%。结论灭活CVB1也能像腺病毒一样促进基因转移，CVB1的嗜肌肉特性，为在肌肉组织中研究靶向明确的新载体提供了实验依据。【关键词】柯萨奇B1病毒骨骼肌细胞基因 Gene transfer efficiency enhancement by inactivated Coxsakie virus B1 in primary skeletal muscle cellsCHEN Guojun*, LIU Zhuolin, ZHANG Chen, JIANG Lifang, CHEN Yuan, FANG Danyun, YAN Huij

3、un.* Department of Neurology, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510080 P.R.China.E-mail:gjchen【Abstract】ObjectiveTo study the effect of inactivated Coxsackie virus B1(CVB1), which was considered to have high affinity to skeletal muscle cells, on ge

4、ne transfer efficiency of reporter gene, pCDNA3-LacZ, in primary muscle cells.MethodsViruses were purified by polyethylene sedimentation followed by sucrose supercentrifugation. Virus, transferrin-polylysine(TfpL) and LacZ were designed as different concentrations and groups, then positive cells con

5、tained -galactosidase were calculated as gene transfer efficiency.ResultsInactivated CVB1 made an enhancement of gene transfer efficiency from less than 1% in TfpL+LacZ group to 15-20 per cent in CVB1+TfpL+LacZ group.ConclusionLike adenovirus, inactivated CVB1 can also increase gene transfer efficie

6、ncy in muscle cells, which provides experimental basis for constructing new vector targeting to muscel cells.【Key words】Coxsackie virus B1Skeletal muscle cellGene在肌肉细胞的基因转移中，目前最常用的是腺病毒(adenovirus, AV)载体。AV降解溶酶体的特性，还促进了HeLa细胞中转铁蛋白(transferrin,Tf)-聚赖氨酸(polylysine, pL)介导的报道基因转移，效率比TfpL-DNA复合物提高了1000倍1。

7、更有意义的是，在肌细胞中采用该法将灭活AV携带报道基因获得成功，并且宿主的排异反应大为降低，报道基因表达时间延长而基因转移效率并没有明显降低2。但AV载体靶细胞范围广泛也正意味着对肌细胞的特异性不高。柯萨奇B1病毒(Coxsackie virus B1, CVB1)是一种小而无囊膜的单链正股RNA病毒，直径为28 nm，现已将CVB1用来制备稳定的实验性肌炎模型。已经证明CVB1具有嗜肌肉特性并认为与病毒的外壳蛋白有关3，4，目前尚不能将CVB1制成疫苗。为此，我们将灭活CVB1、TfpL和报道基因pCDNA3-LacZ设计成不同浓度和不同组合，在原代培养骨骼肌细胞中进行了基因转移研究，希望在

8、靶向于肌肉细胞的基因治疗中探索一种新思路。1材料与方法1.1CVB1病毒购自中国预防医学科学院毒种室。质粒：pCDNA3-LacZ长约8kb，由巨细胞病毒启动子驱动，本室保存。TfpL为Sigma公司产品。1.2CVB1提纯和灭活参照文献5，6报道的方法加以修改。简言之，聚乙二醇沉淀法将病毒悬液初步浓缩；在10%50%蔗糖梯度中上样，低温超速分步离心；电镜观察并做病毒活性测定；-丙内酯(-propiolactone, BPL)2%浓度灭活，测定残存毒力7。1.3原代骨骼肌细胞培养8取13天新生SD大鼠，断头处死，消毒并取前后肢，去皮去骨并剪碎，胰酶消化3060分钟，50m不锈钢网过滤，常温下1

9、000r/min离心10分钟。无血清混合培养基重悬，计数并接种于6孔板内，每孔105个细胞。前3天每天换液(F-10DMEM高糖培养基=5050，10%小牛血清)，3天后隔天换液。1.4基因转移试验(1)肌细胞培养至第3天时，细胞的50%80%融合，试验前吸去培养基，用无血清培养基洗一次。(2)液为pCDNA3分别按3 g、6 g、15 g和50 g溶于20 mmol/L HEPES(含有150mmol/L NaCl)100l中。液为TfpL分别按10g、20g和30g溶于20mmol/L HEPES(含有150mmol/L NaCl)100l中。使用前取溶液缓慢逐滴加入溶液中，总量达200l

10、，室温静置30分钟。(3)将上述液体加入6孔板内的细胞中，然后加800l无血清混合培养基，随后各加入6l、10l和20l的灭活CVB1液(6.4×1012病毒颗粒/ml)，对照组加入同体积的病毒贮存液。37继续培养46小时，取出后加入12.5%的混合培养基4ml，继续培养20小时。(4)换液继续培养24小时。1.5X-gal染色参照文献9的方法。1.6阳性细胞计数每个显微镜视野计取每1000个细胞中X-gal染色阳性的肌细胞数。2结果2.1各种浓度的质粒和TfpL对转染效率的影响经酚-氯仿提取后的质粒能满足一般的基因转移需要。本实验中15 g DNA与10 g TfpL为最佳组合，出

11、现了1%2%的阳性细胞。即DNA与TfpL之比为32(1)。由1可见，被染蓝的部分位于细胞浆内，细胞形态保持良好(箭头所指，下同)。1TfpL组出现1%2%的阳性细胞Fig 11%-2% positive cells in TfpL group2.2CVB1与TfpL协同作用，使基因转移效率大为提高。10l CVB1(6.4×1010)组产生了5%左右的阳性细胞(2)。当15 g DNA、10 g TfpL与10 l CVB1一起加进骨骼肌细胞时，被染蓝的细胞数增至15%20%，见3，4。说明CVB1促进了TfpL在肌细胞中受体介导的基因转移。质粒DNA、TfpL与CVB1的不同组合

12、对基因转移效率的影响见表1。2CVB1组出现5%的阳性细胞Fig 25% positive cells in CVB1 group3CVB1+TfpL组阳性细胞增至15%20%(×10)Fig 3Positive cells increased to 15%-20% in CVB1+TfpL group(×10)4CVB1+TfpL组阳性细胞增至15%20%(×40)Fig 4Positive cells increased to 15%-20% in CVB1+TfpL group(×40)表1质粒DNA、TfpL与CVB1的不同组合对基因转移效率的影

13、响Tab 1The effect of different combinations of DNA,TfpL and CVB1 on gene transfer efficiencyDifferent combinations(各种组合)Percentage of positive cells(阳性百分数)(%)pCDNA3 lacZ+TfpL12pCDNA3 lacZ+CVB15pCDNA3 lacZ+TfpL+CVB115203讨论 实验中，单纯质粒DNA用至50g都未获得阳性结果，TfpL组的转移效率仅为1%左右。可能与肌细胞膜屏障有关，但确切原因还不清楚。CVB1组获得了5%阳性细胞，

14、说明CVB1具有促进基因转移的作用，已经证明，CVB1感染在HEP-2细胞中能增加细胞通透性，促进细菌入侵10。灭活CVB1与TfpL共同作用，使转移效率增加到15%20%，推测CVB1使肌细胞对DNA摄取增加，或可能降低了溶酶体对外源物质破坏的能力 。实验说明，灭活CVB1也能象灭活AV一样促进基因转移，用灭活CVB1构建的载体，体积小于AV复合物，有可能在越过细胞的分子屏障中发挥优于AV的作用。灭活CVB1同时避免了因活病毒所引起的免疫损伤，由此构建的CVB1-pL-DNA复合物同时具有靶向明确和促进基因转移的特点，简单操作，效率高。实验的意义还在于，用组织特异性灭活病毒作载体，将作为一种

15、新思路，不仅为肌肉病，而且还为其它组织疾病的基因治疗如灭活肝炎病毒治疗肝癌，灭活脑炎病毒治疗脑组织退行性疾病提供了一种靶向明确的、高效的基因转移方法。本课题受国家自然科学基金(39800045)和卫生部临床重点项目基金(97040229)资助作者单位：陈国俊刘焯霖张成（510080广州，中山医科大学附一院神经内科）江丽芳陈元方丹云晏辉钧（微生物学教研室）参考文献1Curiel DT, Agarwal S, Wagner E, et al.Adenovirus-enhancment of transferrin-polylysine-mediated gene delivery. Proc Na

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