硫酸镍与芪归解毒汤对人晶状体上皮细胞中HSP27表达的影响

1、硫酸镍与芪归解毒汤对人晶状体上皮细胞中HSP27表达的影响        【摘要】     目的：探讨硫酸镍损伤后人晶状体上皮细胞（lens epithelial cell,LECs）中热休克蛋白27（heat shock protein 27,HSP27）表达情况，并给予芪归解毒汤干预，观察晶状体上皮细胞HSP27表达的变化。 方法：体外培养正常人晶状体上皮细胞分为正常组，硫酸镍组和中药组，分别作用24h后，逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测晶状体上皮细胞HSP

2、27 mRNA的表达水平。 结果：硫酸镍损伤可造成晶状体上皮细胞HSP27 mRNA表达水平上调(P<0.05)，预先的中药干预能使HSP27 mRNA表达水平上调(P<0.05)。结论：硫酸镍损伤后晶状体上皮细胞HSP27 mRNA表达水平上调，给予预先的中药干预可能通过提高HSP27的表达水平从而保护晶状体上皮细胞。关键词：热休克蛋白质；晶状体上皮细胞；白内障；逆转录聚合酶链反应     【关键词】  热休克蛋白质 晶状体上皮细胞 白内障 逆转录聚合酶链反应    0引言 

3、60;  热休克反应是一种机体应对损伤的快速、短暂、保守的细胞应激反应过程1，在自然界，动物和植物细胞通过产生热休克蛋白（heat shock protein,HSP）对抗应激2。Bagchi等3,4发现在体外培养的小鼠晶状体上皮细胞受到氧化、高渗刺激后HSP70表达增高，姚克等5实验证实钝挫性眼外伤可造成晶状体上皮细胞的HSP27表达增高，但镍及其化合物是否能够造成晶状体上皮细胞的HSP表达增高，尚未见相关报道。镍与白内障密切相关，对镍矿区员工的调查研究发现，镍矿区工作人员白内障的发病率远高于非接触人群，白内障晶状体中镍含量明显高于正常透明晶状体6，7，硫酸镍对人眼晶状体上皮细胞的

4、增殖具有明显的抑制作用，呈明显的剂量效应关系，并能诱导晶状体上皮细胞凋亡8。我们研究硫酸镍损伤后晶状体上皮细胞（lens epithelial cell, LEC）HSP27的表达情况以及给予中药芪归解毒汤药物血清后对LEC HSP27表达的影响。1材料和方法1.1材料  芪归解毒汤（黄芪、当归、土茯苓、连翘、郁金、丹参、菊花、枸杞子）由上海中医药大学附属普陀医院中药房提供，水煎，浓缩为含生药4kg/L，4冰箱保存备用；硫酸镍。SD大鼠，雄性，体质量180±20g，由上海中医药大学附属普陀医院实验动物中心提供。正常人永生化晶状体上皮细胞株(细胞编号：SRA01/04，上海肯

5、强生物工程公司)，本实验室传代培养。二氧化碳培养箱（日本Sanyo公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；低温冰箱（日本Sanyo公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；Onetube Expand RTPCR system(瑞士Roche公司)；PCR仪（美国PE公司）；DNR凝胶成像系统（以色列DR公司）。1.2方法1.2.1人眼晶状体上皮细胞培养  LEC冻存于液氮中，用时复苏。培养液为DMEM低糖培养基，含100mL/L胎牛血清，100kU/L青霉素、链霉素，用NaHCO3调至pH=7.4。在37、50mL/L CO2培养箱中进行培养。将体外培养的

6、人LECs分为3组：（1）正常对照组：正常人晶状体上皮细胞+DMEM低糖培养液；（2）硫酸镍组：正常人晶状体上皮细胞+空白对照组培养液+硫酸镍（终浓度162.71mg/L）；（3）中药组：正常人晶状体上皮细胞+硫酸镍组培养液+200g/L芪归解毒汤药物血清6mL。芪归解毒汤药物血清的制备 SD大鼠24只。每笼6只，饲养温度23±1，湿度40%70%。适应性饲养1wk后，大鼠根据质量随机分为2组：正常组和给药组。根据“人和动物之间按体表面积折算的等效剂量比值表”计算出大鼠等效剂量（相当于70kg成人用量），按照10mL/kg给大鼠灌喂，正常对照组给予等量生理盐水。2次/d，连续灌喂3d

7、。末次灌胃后1h，腹主动脉采血，3000r/min离心15min后，分离血清（切忌取到血细胞），血清呈透明、清亮、淡黄色、无沉淀、未溶血，经56，30min灭活处理后，用0.22m微孔滤膜过滤除菌，20保存备用，1mo内使用。1.2.2晶状体上皮细胞HSP27 mRNA表达的检测  采用Trizol试剂抽提各实验组细胞的总RNA。取少量总RNA用紫外分光光度仪测A260/A280，利用A260计算RNA浓度，并稀释至0.5g/L，逆转录获得的cDNA为模板，PCR扩增目的片段。20L逆转录反应体系中含：5倍逆转录缓冲液4L，10mmol/L dNTP 2L，MMLV逆转录酶200U，

8、RNA 3g，Oligo（dt）18 2L，RNAfree水补至20L。25L PCR体系中含：10倍的缓冲液2.5L，Mg22mmol/L,2.5mmol/L dNTP 2L, 10mmol/L上下游引物各0.5L（表1）。扩增条件：95预变性5min，95变性30s，57退火30s，72延伸30s，循环35次，72延伸10min，4保存产物。取20L PCR产物进行12g/L琼脂糖凝胶电泳，以DNR凝胶成像系统分析凝胶电泳图，Biorad Qnoutity One软件进行灰度分析，重复4次。     统计学处理：运用SPSS 15.0软件包进行分析，数据以&#

9、177;s表示，组间均数的总体差异用方差分析，组间比较用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。2结果    培养的正常人LEC中 HSP27 mRNA表达水平较低，硫酸镍损伤24h后表达增高，中药干预后HSP27表达进一步增高（图1，2）。中药组HSP27 mRNA表达转录强度均较硫酸镍组高，差异有统计学意义（P<0.05）。3讨论    热休克蛋白是细胞在环境温度升高或非生理条件下被诱导产生的蛋白质，由热休克基因所表达。HSP最初是从经历热刺激(从25 移到30 ，30 min)的果蝇唾液腺中发现，故取名热休克蛋白1

10、。以后发现有机体在经受其他刺激如缺血、缺氧、重金属等作用之后，细胞产生多种变化，最终影响蛋白质的结构和功能，并能诱导生成热休克蛋白，启动内源性保护机制。热休克蛋白的基本功能为帮助蛋白质的正确折叠、移位、维持及降解4。作为分子伴侣的HSP的主要功能有：1）帮助细胞内新生蛋白质的正确折叠9；2）热休克后，恢复变性蛋白或加速其降解10。通过本实验，发现晶状体上皮细胞在应激之前HSP27有基础表达。Bagchi等3还发现HSP27存在于人眼晶状体全层，其作用可能是防止变性蛋白质进一步变性或积聚的作用。表1  HSP27和GADPH引物序列（略）图1  RTPCR电泳图 （略）

11、60;1:正常对照组GADPH基因235bp；2:正常对照组HSP27基因413bp；3:镍损伤组GADPH基因；4:镍损伤组HSP27基因；5:镍损伤加中药保护组GADPH基因； 6:镍损伤加中药保护组HSP27基因； M分子质量Marker图2  HSP 27mRNA表达水平aP晶状体是人眼视觉系统的重要组成部分，本身无血管及神经供给，容易遭受各种刺激因子的损害，蛋白质发生变性，透明晶状体出现混浊，发生白内障。镍是现代工业及人们日常生活中广泛应用的一种金属，我国是产镍大国，从事采矿、选矿、冶炼、加工镍的职工已超过了10万人。对镍矿区员工的调查研究发现，镍矿区工作人员白内障的发病率

12、远高于非接触人群，白内障晶状体中镍含量明显高于正常透明晶状体，硫酸镍对人眼晶状体上皮细胞的增殖具有明显的抑制作用，呈明显的剂量效应关系，并能诱导晶状体上皮细胞凋亡6,7。因此，探索如何防治镍接触人群白内障的发病是一项重要的工作。    Cekic等11测量老年型白内障晶状体内微量元素含量，发现镍含量较对照组明显增高。Swanson12用不同年龄组的正常透明晶状体和白内障晶状体测量其微量元素镍的含量，结果显示镍在白内障晶状体中含量要比正常透明晶状体中的含量要高的多。Garcia等13在临床上发现一对镍接触性皮炎伴发白内障的姐妹。Heydenreich认为镍离子是白内

13、障致病因子，对晶状体有破坏作用。Jacob等14发现，当Ca2+存在时，镍可增加K+、Na+的通透性，损害晶状体。张兴儒等6对国内最大的镍矿工业区的流行病学调查发现，镍作业人员晶状体浑浊检出率(53.5%)明显高于对照组(17.0%)，差异有非常显著性(P< 0.01)，且晶状体浑浊的程度也较对照组重。对晶状体中的镍含量对比测量分析，发现白内障晶状体中镍含量明显高于正常透明晶状体组，差异有显著性(P<0.05)，直接接触镍矿的白内障晶状体中的镍含量明显高于镍矿区市民和上海市民的白内障晶状体中镍含量，差异有显著性(P<0.05)，说明从事镍矿采矿、造矿、冶炼及加工中可能使人体晶

14、状体中的镍含量增加，它可能是镍矿工人中晶状体浑浊增加的原因15。    芪归解毒汤是由黄芪、当归、土茯苓、连翘、郁金、丹参、菊花、枸杞子按一定的比例配制而成，是在防治镍毒性的方剂扶正解毒汤16的基础上结合眼部的具体特征和白内障发病特点而得出。针对白内障的发病特点：以虚（肝肾亏虚、脾气虚弱）为本，以实（肝热上扰）为标17。采取以补益肝肾养血以固本，利湿化淤解毒治其标，标本兼顾的原则研制而成。方中黄芪、当归扶助正气，补益气血，气血双补；土茯苓、连翘利湿解毒；佐以丹参，郁金活血通络；菊花、枸杞子明目解毒。全方标本兼治，共奏补益肝肾气血、化淤利湿解毒之功。本研究结果证实，

15、硫酸镍损伤可造成晶状体上皮细胞HSP27表达的增强，提示HSP27可能在重金属损伤过程中对晶状体变性蛋白起保护作用，给予中药药物血清干预后能够提高HSP27的表达，并可能通过提高HSP27的表达保护晶状体。    【参考文献】  1 Pelham H. Heat shock protein: coming in from the cold. Nature1988；332:7767772 Lippa S. Kajanne R, Arminen L, et al. Differentiation induction of HSP70encoding

16、 genes in human kematopoietic cell.J Biochem2001；276:31713317193 Bagchi M, Katar M, Maisel H, et al. Effect of exogenous stress on the tissuecultured mouse lens epithelial cells. J Cell Biochem2002；86:3023064周星利,元泽峰,李凌,等.热休克蛋白与白内障发生的研究进展.国际眼科杂志2008;8(4):7887905饶惠英，姚克，汤霞靖，等.大鼠顿挫性眼外伤动物模型中晶状体上皮细胞热休克蛋白70和27的表达及其6热耐受的调节作用.中华眼科杂志2006；42(3):2412426张兴儒，王佩秋，郭根来.镍钴作业对人眼损伤的初步研究.眼科19