棕榈酸抑制胰岛MIN6 β细胞生长的分子机制

1、棕榈酸抑制胰岛MIN6 细胞生长的分子机制         11-01-28 15:08:00     编辑：studa20                   作者：崔巍, 黄葶, 刘均利, 施秉银 【摘要】  目的: 观察饱和脂肪酸棕榈酸（Palmitate, PA）对小鼠MIN6细胞

2、生长的影响, 从细胞周期角度来探讨其发生的分子机制。方法: 采用5 g/L BSA代替血清培养36 h使MIN6细胞同步化处于G0期。然后用PA（0.251.0 mmol/L, 45 min24 h）干预, 采用MTT法检测细胞活力, 流式细胞术测定细胞周期, 采用Westen blot检测细胞周期相关蛋白CDK4、 CyclinD1表达水平的变化。结果: 和对照组相比（1）不同浓度PA均显著抑制MIN6细胞增殖（P0.01); （2）PA亦能明显抑制细胞周期进程, 使MIN6细胞周期更多滞留在G0/G1期(P<0.01), G2/M期与S期细胞比例降低(P<0.01); （3）P

3、A能显著的抑制细胞周期相关蛋白CDK4、 CyclinD1的表达（P0.05）, 并与细胞周期延迟一致。结论: PA抑制MIN6细胞生长可能是通过降低MIN6细胞的细胞周期相关蛋白cyclin D1/CDK4的表达, 导致从G1S期的阻滞, 从而减弱细胞增殖。 【关键词】  胰岛细胞; 棕榈酸; 细胞周期; 增殖AbstractAIM:  To investigate the effect of saturated fatty acid Palmitate (PA) on cell viability of MIN6 cell and the possible cell c

4、ycle pathways affected by PA. METHODS:  MIN6 cells were synchronized at G0 phase by serum deprivation for 36 h,  and further MIN6 cells were exposed to different concentrations of PA（0.25-1.0 mmol/L,  45 min-24 h）compared with control cell treated with BSA.Cell viability was assessed

5、by MTT colorimetric assay. The cell cycle was measured by FACS analysis,  and cell cycle proteins were further detected using Western blot. RESULTS:  (1) PA significantly affected the cell viability of MIN6 cells. (2) The G0/G1 cell cycle arrest (n=6,  P<0.05) also induced by PA,&#

6、160; whereas MIN6 cells in S and G2/M phase were decreased. (3) For cell cycle proteins,  PA treatment caused significant reductions in cyclin D1 and CDK4 levels,  which was consistent to the cell cycle delay.  CONCLUSION: The findings thus suggest that increased PA directly affects p

7、ancreatic cell proliferation,  possibly by reducing the levels of cyclin D1/CDK4 in the cells,  which results in arresting in progression through the G1 phase to the S phase of the cell cycle.Keywordspancreatic cells; Palmitate; cell cycle; proliferation在肥胖个体和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus

8、, T2DM）患者中常有饱和游离脂肪酸（free fatty acids, FFA）的升高, 研究发现, 饱和FFA的升高可能与胰岛细胞凋亡和功能障碍及胰岛素抵抗密切相关。本实验以小鼠MIN6 胰岛细胞瘤株（以下简称MIN6细胞）为实验对象, 观察不同浓度饱和脂肪酸（棕榈酸, Palmitate, PA）对体外培养下的MIN6细胞的生长的影响, 进而从细胞周期角度来探讨其发生的分子机制。1  材料和方法11  材料 MIN6细胞株(1630代)由加拿大McGill大学刘均利教授提供。DMEM培养基、胎牛血清(Gibico)、AntibioticAntimycoti

9、c (100X)购自Invitrogen 公司。ECL高级 Western blotting 检测试剂盒购自Amersham公司, 抗小鼠cyclinD1, CDK4多克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司, 辣根过氧化物酶结合二抗购自美国Jackson Immunolaboratories。无FFA的牛血清白蛋白（BSA）及其余化学试剂均购自美国Sigma公司。12  方法121  游离脂肪酸的配制 用0.1 mol/L的NaOH溶液在70水浴中溶解一定量的PA, 振荡混匀10 min, 然后过滤, 配成100 mmol/L的PA储

10、存液。在55水浴中用去离子水配50 g/L的BSA溶液, 过滤。然后将上述的PA溶液和BSA溶液按119的体积比混合配成5 mmol/L PA/50 g/L BSA复合液。复合液在水浴中振荡10 s后继续水浴10 min, 取出后冷却至室温, 过滤。然后将上述复合液分别用无血清的含葡萄糖25 mmol/L的DMEM培养液以15和110的比例稀释成1.0 mmol/L PA/1 g/L BSA和0.5 mmol/L PA/5 g/L BSA的终浓度; 用无血清的含葡萄糖25 mmol/L的DMEM培养液以110和120的比例稀释成0.5 mmol/L PA/5 g/L BSA和0.25 mmol

11、/L PA/2.5 g/L BSA的终浓度1。122  细胞培养 MIN6细胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液（25 mmol/L葡萄糖, 10 mmol/L的丙酮酸钠, 10  mmol/L的HEPES, 2 mmol/L的L谷氨酰胺, 及55 mol/L的巯基乙醇, 10 mL/L AntibioticAntimycotic）在37 50 mL/L CO2的细胞孵箱中培养, 待到MIN6细胞(1820代) 80%左右贴壁, 弃去原有培养液, 用无血清的含5 g/L BSA和0.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液对细胞进行36 h同步化培养。然后

12、用无血清25 mmol/L葡萄糖DMEM培养液含不同浓度的PA和BSA进行干预, 分组如下: (1)2.5 g/L BSA; (2) 5 g/L  BSA; (3)10 g/L BSA; (4)0.25 mmol/L PA/2.5 g/L BSA; (5)0.5 mmol/L PA/5 g/L BSA; (6)1 mmol/L PA/10 g/L BSA。123  MMT法测定细胞增殖情况  将MIN6细胞按每孔5×103种于96孔培养板, 待细胞80%贴壁, 细胞同步化36 h, 弃去原有培养液, 加入含不同浓度PA/BSA的培养液干预。实验组分别是终

13、浓度为0.25、 0.5、 1 mmol/L的PA; 同时分别设3组含2.5、 5、 10 g/L BSA的对照组。每组10个复孔, 每孔总反应体系为200 L。按照设定的时间6 h, 16 h和24 h, 在倒置显微镜下观察细胞并记录细胞形态; 然后每孔加入MTT 10 L, 继续培养4h。弃去上清液, 每孔加入二甲基亚砜150 L, 振荡10 min, 酶标仪（Spectramax M2 Molecular Devices）测定550 nm下各个组实验对象的吸光度。124  细胞周期分析 将MIN6细胞按每孔5×104种于12孔培养板, 待细胞80%贴壁, 细

14、胞同步化36 h, 弃去原有培养液, 加入含不同浓度PA/BSA的培养基。每组设3个复孔。干预24 h分别消化细胞, 离心收集悬浮和贴壁细胞, 用4 预冷的PBS缓冲液洗细胞2遍后, 然后用结合缓冲液重悬细胞, 调节细胞的密度为109/L。每个样本取100 L的细胞悬液, 加入10 L的碘化丙锭（PI, 20 mg/L）溶液和100 mg/L RNA酶的结合缓冲液, 混匀后置于37水浴箱30 min, 在每个样本中加入400 L结合缓冲液, 上细胞流式仪（BD公司, 型号: FACSCalibur)测量细胞周期分布并分析。125  蛋白的分析 将MIN6细胞按每孔106种于

15、100 mm有盖培养皿, 待细胞80%贴壁, 细胞同步化36 h, 弃去原有培养液, 加入含不同浓度PA/BSA的培养液。每组设3个, 按照设定的时间45 min、6 h、 16 h和24 h, 采用蛋白裂解液（150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris, pH7.4, 1 mmol/L EDTA,1 mmol/L EGTA, 100 mL/L Triton X100, 5 mL/L Nonidet P40, 100 mmol/L NaF, 10 mmol/L焦磷酸钠, 10 mmol/L原钒酸钠,  蛋白酶抑制剂Roche Applied Science）在4提取细胞蛋白。用Brad法蛋白定量, 50g蛋白被130 mL/L聚丙烯酰胺、1 mL/L