人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备

1、人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备         11-02-08 10:08:00     编辑：studa20                    作者：陈章权*, 黄震, 梁晓东, 陆田田, 何天文【摘要】  目的: 原核细胞表达人CD1d分子胞外区及制

2、备其多克隆抗体。方法: 用RT-PCR法扩增人CD1d分子胞外区基因, 将其克隆入原核表达载体pET28中, 转化大肠杆菌BL21（DE3）, 用IPTG诱导重组蛋白的表达, 用亲和层析法纯化重组蛋白, 以之为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体, 并以ELISA、 Western blot及免疫组织化学法检测抗体。结果: 在原核细胞中高效表达和纯化了人CD1d分子胞外区蛋白, 用其免疫小鼠, 获得了效价高、 特异性较好的多克隆抗体, 免疫组织化学检测显示该抗体可识别人小肠组织中的天然CD1d分子。结论: 成功制备了人CD1d分子胞外区重组蛋白及鼠抗人CD1d分子胞外区抗体, 为进一步建立人CD1d分

3、子的免疫学检测方法及其生物学功能的深入研究奠定了基础。 【关键词】  CD1d 基因 表达 抗体 制备CD1分子是独立于MHC分子之外的第三类抗原提呈分子, 分为CD1-I和CD1-II两组, 前者包括CD1a、 CD1b、 CD1c和CD1e等4个分子, 后者只有CD1d分子1。CD1d分子由胞内区、 跨膜区和胞外区组成, 胞外区又由1、 2和3等3个结构域组成, 它主要提呈糖脂抗原, 在免疫调节及与感染性疾病、 自身免疫性疾病、 肿瘤等疾病的发生发展过程中起重要作用1, 2。在CD1d基因克隆过程中, 我们发现在某些疾病患者体内存在3结构域或跨膜区缺失的变异体, 跨膜区缺失的变异

4、体的存在提示患者体内可能存在可溶性CD1d分子。为此, 我们拟建立双抗体夹心ELISA法进行可溶性CD1d分子的检测, 但目前尚未见有其商品化ELISA检测试剂盒。特异性抗体的获取是建立ELISA检测方法的关键所在, 在成功制备兔抗人CD1d分子 3结构域抗体3的基础上, 我们又对人CD1d分子胞外区编码基因进行了重组表达, 并制备了其鼠源性抗体。1  材料和方法1.1  材料  大肠杆菌DH5、 大肠杆菌DL21-DE3为本室保存。克隆载体pGEM-T、 反转录试剂盒购自Promega公司; 表达载体pET28和Ni2+-NTA凝胶为Invitrogen公司产品

5、。RNA提取试剂、 PCR产物回收、 质粒纯化试剂盒为QiaGen公司产品。Taq酶购自大连宝生物工程公司。IPTG及DAB购自上海生物工程有限公司。HRP标记的羊抗鼠IgG为Chemicon公司产品。PVDF膜为美国PALL公司产品, 常规试剂为国产分析纯。引物合成及DNA序列测定委托上海生物工程公司完成。BALB/c小鼠由广东医学院实验动物中心提供。1.2  方法1.2.1  CD1d分子胞外区编码基因的克隆  取手术切除的新鲜人小肠组织抽提RNA, 经鉴定RNA无降解后进行反转录, 操作按反转录试剂盒说明进行。以合成的cDNA为模板进行hCD1d 胞外区编码

6、基因扩增, 引物如下: 1: 5-CCATGGTCCCGCAAAGGCTTTTCCC-3(划线部分为Nco I酶切位点), 引物2: 5-CTCGAGCCAGTAGAGGACGATGTCCTG-3(划线部分为Xho I酶切位点)。PCR 条件为94变性30 s, 55退火50 s, 72延伸40 s, 32个循环后, 于72延伸7 min。PCR 产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化。将纯化的PCR产物与pGEM-T载体连接后, 转化感受态大肠杆菌DH5。转化菌液涂布于含氨苄青霉素、 X-gal和IPTG的LB平板, 于37培养过夜, 挑取白色菌落进行培养, 提取重组质粒, 以Eco

7、R I进行酶切鉴定, 将质粒命名为pGEM-T/hCD1d。阳性克隆进行DNA 测序, 对所得序列用BLAST 软件进行序列同源性分析。1.2.2  原核表达载体的构建  用Nco I和Xho I分别对pGEM-T/hCD1d质粒和原核表达载体pET28进行双酶切,  凝胶电泳后, 纯化回收切下的hCD1d基因片段和pET28片段, 并用连接酶将2个片段16连接过夜, 连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞, 然后将菌液涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB平板, 筛选阳性表达克隆, 进一步用 PCR和测序进行鉴定, 命名为pET28/hCD1d。1.2.3 

8、; 目的蛋白的诱导表达  重组质粒pET28/hCD1d转化感受态菌大肠杆菌BL21(DE3), 37培养过夜。挑取菌落经PCR筛选及测序鉴定正确后, 接种于 LB液体培养基（含50 mg/L卡那霉素）, 37培养过夜后, 按1100比例接种到LB液体培养基中, 待菌液的A600值达0.5 0.6时加入IPTG(终浓度为1 mmol/L), 37诱导表达5 h, 离心收集菌体, 超声破碎后,   分别取细菌裂解上清、 沉淀部分及总菌蛋白行SDS-PAGE分析, 取未经诱导的重组菌为对照。1.2.4  蛋白复性与纯化  离心收集500 mL经诱导

9、表达的菌体, 冰浴条件下超声破菌, 15000 g离心15 min, 分别收集上清和沉淀。SDS-PAGE确定目的蛋白主要存在于沉淀中后, 用洗涤液（50 mmol/L PBS, pH8.0, 1 mmol/L EDTA, 2 mol/L尿素）洗涤沉淀。离心后获取沉淀溶于8 mol/L的尿素中, 用稀释法对包涵体进行复性处理。将溶解的产物用复性缓冲液（20 mmol/L PBS, pH8.0, 1    mmol/L还原型谷胱甘肽, 1 mmol/L氧化型谷胱甘肽）行稀释复性过夜。离心收集上清, 用Ni2+-NTA凝胶柱进行纯化, 200 mmol/L咪唑洗脱,

10、具体操作步骤按说明书进行。1.2.5  抗体的制备、 纯化及鉴定  取6周龄小鼠,用纯化的重组蛋白加福氏完全佐剂, 皮下多点注射, 共免疫3次, 间隔时间为2周, 每次注射抗原50 g。免疫完毕, 摘除小鼠眼球取血、 分离血清。用间接ELISA法检测抗体效价, 用Western blot进行抗体特异性鉴定, 方法参照文献4进行。应用所制备的抗人CD1d抗体检测人肠组织石蜡切片, 进行免疫组织化学检测, 对抗体的活性作进一步的分析,  多抗按1500稀释, 采用DAB显色。同时以正常小鼠血清作对照。2  结果2.1  CD1d分子胞外区编码基因的

11、扩增与鉴定  PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析, 在约850 bp处见有一特异条带, 与预期的目的片段大小相符。提取质粒, 经PCR和Nco I与Xho I双酶切鉴定, 扩增产物和酶切下来的片段与预期的片段大小相符, 经进一步测序鉴定, 得到CD1d胞外区编码基因片段为825 bp, 用BLAST程序分析, 序列与GenBank登录的序列(登录号: NM 001766)一致, 阳性克隆命名为pGEM-T/hCD1d（图1）。图1  hCD1d 胞外区编码基因扩增产物（略）Fig 1  The PCR products of the gene codi

12、ng for  hCD1d extracellular regionM: DNA marker; 1, 2: PCR product of hCD1d extracellular region.2.2  表达载体pET28/CD1d的构建与鉴定  构建的原核表达质粒pET28/hCD1d经PCR筛选和DNA序列测定, 结果显示目的片段大小为825 bp, 正确插入质粒pET28, 碱基序无突变, 阅读框正确, 可用于下一步的诱导表达。2.3  重组蛋白的诱导表达、 纯化与鉴定  将表达质粒pET28/hCD1d转化大肠杆菌BL21（DE3）,&

13、#160; 得到含重组质粒的基因工程菌。经IPTG诱导, SDS-PAGE分析, 结果显示在相对分子质量（Mr）约30000处有一条外源的高表达蛋白条带, 与预测的目的蛋白的Mr大小相吻合, 而未经IPTG诱导的工程菌未见有外源蛋白表达条带, 仅转入pET28空载体的菌株在IPTG诱导后也未见有外源蛋白表达条带, 表明hCD1d在大肠杆菌中得到了高效表达。超声破菌后, 离心取上清和沉淀行SDS-PAGE分析, 结果显示表达产物大多数在沉淀中, 说明重组蛋白主要以包涵体的形式存在（图2A）。包涵体用8 mol/L的尿素溶解后复性, 离心收集上清, 经Ni-NTA纯化, 得到约2 mg蛋白, 经凝胶扫描分析显示, 所得的蛋白纯度为92%, 纯度较高（图2A）。2.4  抗血清的效价及特异性的鉴定  利用纯化的重组人CD1d为抗原免疫小鼠, 获得鼠抗hCD1d抗血清, ELISA检测效价为112800。以制备的抗人CD1d抗血清