初发急性非淋巴细胞白血病SSBP2 mRNA表达研究

1、初发急性非淋巴细胞白血病SSBP2 mRNA表达研究【摘要】nbsp;nbsp;目的：探讨SSBP2nbsp;mRNA在初发急性非淋巴细胞白血病中的表达。方法：利用半定量RTPCR检测64nbsp;例初发急性非淋巴细胞白血病患者及20nbsp;例正常对照SSBP2nbsp;mRNA表达，以actin作为内参照。结果：64nbsp;例初发ANLL患者及20nbsp;例正 作者：刘伟，王宏伟，郭慧敏，李秋杏，覃艳红，朱 镭，张 丽作者单位：(山西医科大学第二医院，山西 太原 030001) 【摘要】 目的：探讨SSBP2 mRNA在初发急性非淋巴细胞白血病中的表达。方法：利用半定量RTPCR检测6

2、4 例初发急性非淋巴细胞白血病患者及20 例正常对照SSBP2 mRNA表达，以actin作为内参照。结果：64 例初发ANLL患者及20 例正常对照均表达SSBP2。与正常对照比较，初发ANLL患者SSBP2 mRNA表达水平为(0.4100.216)与对照组(0.3830.172)差异无显著性(P0.05)。结论：初发ANLL中SSBP2 mRNA表达无异常改变，SSBP2表达可能并不参与急性非淋巴细胞白血病的发生。 【关键词】 白血病；急性；单链DNA结合蛋白2；逆转录聚合酶链反应 The expression of SSBP2 mRNA in primary acute nonlymp

3、hocytic leukemia LIU Wei，WANG Hongwei，GUO Huimin，LI Qiuxing，QING Yanhong，ZHU Lei，ZHANG LI (The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China) Abstract Objective：To explore SSBP2 mRNA level in primary acute myeloid leukemia patients.Methods：Reverse transcription Polymerase chain r

4、eaction(RTPCR) was used to assay the expression level of SSBP2 mRNA in 64 cases of primary acute myeloid leukemia(ANLL)and 20 normal cases，actin was used as contral gene.Results：SSBP2 was normally expressed in 64 cases of primary ANLL and 20 normal cases.The SSBP2 mRNA level in primary ANLL(0.4100.2

5、16) was no statistically significant difference compared with in normal cases(0.3830.172)(P0.05)。Conclusions：Expression of SSBP2 mRNAwas not changed in the primary ANLL patients，expression of SSBP2 may be not involved in the development of ANLL. Key word leukemia；acute；singlestranded DNAbinding prot

6、ein 2；RTPCR 急性非淋巴细胞白血病(ANLL)是骨髓造血干细胞的恶性克隆增生性疾病，基因损伤是ANLL的常见现象。单链DNA结合蛋白2(singlestranded DNA binding protein 2，SSBP2)能够抑制细胞异常增殖，诱导细胞的分化，Qian1等在治疗14 例相关性AML的患者中检测出9 例表现为SSBP2表达下调，但在初发ANLL中的表达目前还不很明了。为此我们利用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)半定量检测64 例初发ANLL患者SSBP2 mRNA表达水平，报告如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料 收取2007年2月2007年12月初诊ANLL 64

7、 例，其中男36 例，女28 例，年龄1169 岁。FAB分型：M0 1 例，M2 18 例，M3 32 例，M4 7 例，M5 5 例，M7 1 例，所有入选病例均经形态学、流式细胞术免疫分型联合确诊，且未进行临床化疗。正常对照选取非白血病患者20 例。 1.2 实验方法 1.2.1 引物设计 利用Primer 5.0软件设计引物，由北京奥科生物公司合成，SSBP2上游序列为5AATGGCTCTCTTTAGCTCAGGA3，下游序列为5CCAACCTTTTTATTTCCTGCTC3，扩增产物片段大小310bp。actin作为内参基因，其上游序列为5GGAAATCGTGCGTGACATTAAG

8、3，下游序列为5GGACTCGTCATACTCCTGCTTG3，扩增产物片段大小478bp。 1.2.2 总RNA的提取 参照美国GENTRA公司总RNA提取试剂盒说明步骤提取，所提取总RNA经紫外分光光度仪测定其260nm和280nm处的吸光度(A)值，选取A260/A280比值1.82.0者，以A260计算出浓度，用于逆转录反应。 1.2.3 逆转录反应 参照美国Ferments公司生产的逆转录试剂盒进行操作。总反应体积为20 L反应步骤为总RNA 1 g，random primer 0.4 g，加DEPC水至11 L，705 min后置于冰上加入5buffer 4 L，10 mmol/L

9、 dNTP 2 L，RNasin 20 U，255 min置于冰上并加入200 U/L MMLV 1 L，2510 min，4260 min，7010 min结束反应。反应产物作PCR扩增用。 1.2.4 确定PCR线性扩增最佳反应循环数 通过对SSBP2基因及actin基因同时进行24，26，28，30，32，34，36，38个循环数的扩增，2琼脂糖凝胶电泳，利用美国UVP凝胶成像仪软件检测扩增产物灰度值，绘出线性曲线图，选择扩增产物在直线增长期的循环数为PCR实验的循环数。 1.2.5 PCR实验 反应体系25 L，具体cDNA 1 L，10buffer 2.5 L，25 mmol/L M

10、gC 121.5 L，10 mmol/L dNTP 2.5 L，TaqDNA酶1.5 U(美国Ferments公司产品)，20 mol/L上游引物与下游引物各1 L，去离子水补足25 L。SSBP2基因及actin基因同批分管进行扩增，反应条件为952 min，95 30 s，5530 s，7245 s，扩增26个循环后迅速取出actin基因反应管，至28个循环结束后再迅速放入PCR仪，72共同总延伸10 min。为了排除PCR过程可能出现的假阳性，每次扩增均设立空白对照(以去离子水代替目的cDNA)。 1.2.6 PCR产物进行电泳及半定量分析 取SSBP2基因和actin基因PCR扩增产物

11、各3 L混入2 L上样液，在2琼脂糖凝胶中电泳，利用美国UVP凝胶成像仪拍摄电泳图片检测SSBP2基因与actin基因扩增产物灰度值。以SSBP2与actin灰度值的比值作为SSBP2 mRNA的相对表达量。 1.3 统计学分析 SSBP2 mRNA表达量以s来表示，用SPSS13.0软件进行分析。方法采用两样本t检验，P0.05表示差异有显著性。 2 结 果 2.1 PCR产物电泳结果及PCR线性扩增最佳反应循环数的确立 PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳验证，扩增产物片段大小与预先设定大小一致，SSBP2与actin经过24，26，28，30，32，34，36，38个循环扩增后检测各个循环数

12、的PCR产物灰度值，通过作图分析扩增最佳循环数，结果显示actin内参基因为26个循环，SSBP2基因为28个循环。 2.2 SSBP2 mRNA在ANLL患者与正常对照中的表达 64 例初发ANLL患者和20 例正常对照均表达SSBP2，初发ANLL患者的SSBP2 mRNA相对表达量为0.4100.216与对照组SSBP2 mRNA相对表达量0.3830.172比较差异无显著性(P0.05)。 3 讨 论 白血病是以造血干细胞分化受阻、克隆性细胞增殖异常以及凋亡抵抗为主要特征的恶性血液病。许多与细胞增殖、分化及凋亡有关的基因功能的改变参与了白血病的发生和发展。SSBP2是一个高度保守的转录

13、调控因子，可参与细胞周期的调控，介导细胞的分化。Liang等2发现HL60，TF1，U937，HEL等细胞株中SSBP2表达缺失，SSBP2可抑制髓系白血病细胞的恶性生长并诱导细胞分化，提示SSBP2在机体内可能作为肿瘤抑制基因发挥生物学功能。部分治疗相关性白血病患者存在SSBP2表达的下调，提示SSBP2基因异常可能是白血病形成的分子学机制之一。 本研究以actin作为内参，利用半定量RTPCR技术检测分析了64 例初发ANLL患者SSBP2基因的相对表达量。由于目的基因与内参基因在细胞内表达丰度不同，经PCR扩增进入平台期的循环数随之不同，因此我们首先确定了线性扩增所需的最佳扩增循环数，保

14、证PCR扩增产物灰度值能够反应扩增基因的表达水平，同时为了避免同管扩增带来的引物间竞争抑制，我们采用目的基因与内参基因同批分管进行扩增，确保半定量分析的准确性。结果显示初发ANLL患者与正常对照均表达SSBP2，并且两组SSBP2表达量无显著性差异，初发ANLL患者中SSBP2基因表达水平并无异常改变，提示SSBP2基因的表达可能不是参与初发ANLL发生的因素之一。 Qian等1研究发现部分相关性AML病例伴有SSBP2表达下调，而我们的研究证实SSBP2基因表达水平在初发且未经化疗的ANLL患者中并无异常改变，提示化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时可能会影响到SSBP2的表达，进而干扰造血系统的正

15、常分化，诱发治疗相关性白血病的形成3。白血病细胞株HL60，HEL，TF1，U937等存在SSBP2基因的表达缺失，K562和BVl73细胞株SSBP2则广泛表达，说明SSBP2在不同类型细胞株中可能存在不同的作用机制，进一步分析其信号传导途径及其表现出的生物学功能将有助于深入了解SSBP2与ANLL的关系。 【参考文献】 1 Qian Z，Fenald A A，Godley L A，et al.Expression profiling of CD34hematopoietic stem/progenitor cells reveals distinct subtypes of therapyrelated acute myeloid leukemiaJ.Proc Natl Acad Sci