HPLC法测定白芍和赤芍中1_2_3_4_6_五_O_倍酰_D_葡萄糖含量

1、2008年 10月 第 29卷 第 5期首 都 医 科 大 学 学 报 Jour nal of C apitalM ed icalU niversityO ct . 2008V o. l 29 N o . 5基础研究HPLC 法测定白芍和赤芍中 1, 2, 3, 4, 6 五 O倍酰 D 葡萄糖含量殷志爽 赵文华 宋学英 孔令江 王 桥*(首都医科大学化学生物学与药学院化学生物学系 摘要 目的 用高效液相色谱 (HPLC 法测定白芍和赤芍中 1, 2, 3, 4, 6 五 O 倍酰 D 葡萄糖 (PGG 的含量。 方法 用 50%乙 醇水溶液 , 通过超声提取法从白芍和赤芍 中提取 PGG 。

2、采 用 D ia m onsil C 18色谱 柱 , 流动 相为乙 腈 2. 5%醋酸水 溶液 (18 82, V /V , p H 为 2. 85, 紫外检测波长为 280nm , 流速为 1mL /min 。 结果 PGG 在 5 g /mL150 g /mL范围内呈良好的线性关系 (r =0. 9999, n =5, 平均回收率为 100. 9%, RSD 为 3. 57%(n =9 。 在白芍和 赤芍中 PGG 的 含量分 别为 2. 48mg /g和 2. 24m g /g。 结论 本实验所建立 的测定 PGG 含量的 H PLC 法能够有效消 除白芍和 赤芍中 其他组 分的干 扰

3、 , 操 作简单 快速 , 精密度 高、 重现 性好、 回收率高 , 适用于中药提 取物中 PGG 含量的测定。关键词 1, 2, 3, 4, 6 五 O 倍酰 D 葡萄糖 ; 高效液 相色谱法 ; 白芍 ; 赤芍 中图分类号 R 284. 1D eter m i nati on of 1, 2, 3, 4, 6 penta O gall oyl D gl ucose i n Radi x Paeoniae A l ba and Radi x Paeoniae R ubra w ith HPLCY i n Zhishuang , Zhao W enhua , Song Xuey i n g ,

4、 Kong L i n g jiang , W ang Q iao*(D epartm ent of Che m ical B iology, S chool of Che m ical B iology and Pharmaceutical S ciences , Ca p italM edical Universit y AB STRACT O bjective In recent repo rts , i t has been i nd i cated t hat 1, 2, 3, 4, 6 penta O ga lloy l D g l ucose (PGG i n Ch i nese

5、herba lm ed ici nes i s a natura l acti v e co m ponent w hich exh i bited disti nct anti cancer , anti diabete and an ti obes it y acti v ities . A rap i d , sensitive and reli able m ethod usi ng h i gh pe rf o r m ance li qu i d chro m atography is to be developed for deter m i nati on o f PGG i

6、n R adi x P aeon i ae A lba and Rad i x P aeoniae Rubra . M e thod s PGG was ex tracted w ith 50%ethano l from Rad i x Paeoniae A lba and Rad i x Paeoniae Rubra . Fo r the chrom atographic sepa ra tion and ana l ysis o f PGG, a reversed phase D i amonsil C 18co l u m n(4. 6mm 250mm, 5 m was used at

7、25 w it h an i so cra tic m ob ile phase cons i sti ng o f aceton itril e and 2. 5%acetic ac i d soluti on(18 82, V /V,p H =2. 85. F low rate w as set at 1. 0mL /mi n . A n u ltrav i o l e t de tector was used and w aveleng t h o f detecti on w as a t 280n m. V o l u m e w as 20 L. Resu lts The ca l

8、i bra ti on curv e for PGG was li near over the range of 5 g /mL150 g /mL(r =0. 9999, n =5. PGG was stable w ithi n 48hours and show ed good prec isi on . T he ave rage recov ery w as 100. 9%(RSD =3. 57%, n =9. The contents of PGG i n R adi x P aeon i ae A lba and Radix Paeoniae Rubra w ere 2. 48mg

9、/gand 2. 24mg /g, respectively . Conc l u sion In the present wo rk , a h i gh perfor m ance li qu i d chrom atography m ethod is deve l oped f o r quantitati ve analysis o f PGG in Radix P aeoniae A lba and Radix P aeoniae Rubra . The m ethod is rap i d , sensiti ve , reliab l e , and precise . It

10、is applicab le to deter m i ne PGG in Ch i nese herba lm ed i c i nes . KEY W ORDS PGG; H PLC ; Rad i x Paeoni ae A lba ; Radix Paeoniae Rubra基金项目 :北京市属市管高等学校人才强教计划、 首都医科大学科研基金 (2006ZR09 资助项目 , Support ed by B eiji ngM un i cipalPro j ect f or Devel op i ng Advan ced H um an Resou rces f orH i gher

11、Edu cati on and S ci en tifi c Res earch Foundati on of C ap it al M edical Un i versity(2006ZR09*i t , m a l qiao wcc m u . edu . 白芍 (Radix Paeoniae Alba , RP A 和 赤 芍 (R ad i x PaeoniaeRubra , RPR 为植物毛莨科芍药 (Paconia lacti flora pall . 的根茎 , 均是传统的活血化瘀类中药。其主 要功能为平肝止痛、 养血调经、 清热凉血等。现代药理 学研究1, 2表明 RP A 和

12、 RPR 及其提取物对某些肿瘤有抑制作用。有研究 3 6发现丹皮 (M outan Cortex , 植物毛莨科芍药 Paeonia Suffruticosa ANDRE W S 的根 中含有 1, 2, 3, 4, 6 五 O 倍酰 D 葡 萄糖 (P GG, 具有抗肿瘤、 抗 病毒、 抗糖尿病及减肥等多种药理活性。研究7显示 ,PGG 可以通过抑制血管增生和促进细胞凋亡抑制肿瘤的生长具有较强的抗肿瘤活性。基于 RP A 和 RPR 也 具有消炎及抑制肿瘤的作用 , 本研究建立了从 RPA 和 RPD 中提取、 分析 PGG 含量的 H PLC 方法 , 旨在简单、 快速、 准确地测定 PG

13、G 的含量 , 为研究 RPA 和 RPR 中PGG 的药理活性及其作用机制提供分析方法。1 材料和方法1. 1 仪器和试剂美国 W aters 2695型高效液相色谱系统 (含四元 梯度泵、 PDA 2996型二极管阵列紫外检测器、 在线真 空脱气机、 自 动进 样器、 柱 温箱、 e m po w er 色谱 工作 站 ; GL 88B 涡旋混合器 (江苏依林贝尔仪器制造有 限公司 ; PGG(纯度 >98% 由本研究室提供 ; 白芍和 赤芍购自北 京同 仁堂 药店 ; 乙腈 (色谱 纯 , F isher 公 司 ; 其他试剂为市售分析纯试剂 ; 重蒸水。 1. 2 色谱条件色谱柱

14、 D ia m onsil C 18(4. 6mm 250mm, 5 m ; 迪马公司 ; 柱温 25 。紫外检测波长为 280nm, 流 动相为乙 腈 2. 5%醋 酸水溶 液 (18 82, V /V pH =2. 85, 流速为 1mL /mi n , 进样量为 20 L , 理论塔板数 为 4. 8 103。1. 3 标准溶液的配制及标准曲线的绘制精确称 取 25. 0m g PGG, 用甲醇溶 解后转入 25mL 容量瓶中定容 , 得到 1. 00g /L储备液。用储备液 分别配 制浓 度为 5. 00、 10. 0、 50. 0、 100. 0和 150. 0m g /L的标准溶液

15、系列。按 1. 2色 谱条件 , 每个浓度 进样测定 5次 , 取平均值后 , 用 PGG 的峰面积 S 对浓 度 x 做线性回归。 1. 4 精密度试验取浓度为 50. 0m g /L的 PGG 标准溶液 , 按 1. 2色谱条件连续进样 5次进行测定。1. 5 稳定性及重复性试验取浓度为 50. 0m g /L的 PGG 标准溶液 , 按 1. 2色 谱条件 , 分别在配 制后的 0、 2、 4、 8、 12、 16、 20、 24、 36和 48h 进样分析测定。 1. 6 不同提取方法的比较分别将 RPA 和 RPR 粉碎 , 过 40目筛得到 RPA 和 RPR 样品粉末。准确称取

16、RPA 和 RPR 样品粉末 0. 25g(准确至 0. 001g 各 18份 , 分别置于 50mL 具 塞锥形瓶中 , 加入 10. 0m L 提取剂后称质量。提取剂 分别为 50%乙醇、 60%丙 酮或乙腈 2. 5%醋 酸溶液 (30 70, V /V, 称质量后 , 按下述 2种方法进行提取。方法 1:50 下超声提取 1h , 称质量 , 用相应提 取剂补足失质量 , 静置。方法 2:室温下电磁搅拌提取 24h , 称质量 , 用相 应提取剂补足失质量 , 静置。上清液过 0. 45 m 滤膜 , 滤液按 1. 2色谱条件 , 用 H PLC 测定其中 PGG 浓度 , 计算 PG

17、G 提取率 , 每种 提取方法重复 3次。1. 7 RPA 和 RPR 中 PGG 含量的测定准确称取 RP A 和 RPR 样品粉末 0. 25g(准确至 0. 001g 各 3份 , 分别置于 50mL 具塞锥形瓶中 , 各加 入 50%乙醇提取剂 10. 0m L 后称质量。 50 下超声 提取 1h 后称质量。用提取剂补足失质量 , 静置 , 上清 液用 0. 45 m 滤膜过滤。滤液按 1. 2色谱 条件 , 用 H PLC 分析测定 (图 1。 图 1 白芍 (A 和赤芍 (B 提取液的 HPLC 谱图Fig . 1 Chro m a t ogra m s o f extrac t

18、 s from RPA (A and RPR (B 1. 8 回收率测定采用加 样 回 收率 法 , 准 确称 取 RP A 样 品粉 末 (0. 2568 0. 0027 g 共 9份 , 分别 按 PGG 含 量的 80%、 100%和 120%水平准确加入 PGG 后 , 按 1. 7方法进 行提 取 , 按 1. 2色 谱条 件测 定提 取液 中 PGG 含量 , 计算回收率。 1. 9 统计学处理采用 SPSS 10. 0统计软件进行统计学分析 , 数据 以均数 标准差 ( x s 表示 , 两样本均数比较采用 t 检验 , P <0. 05为差异有统计学意义。2 结果2. 1

19、 标准曲线的绘制在 5. 00m g /L150mg /L范围内 , 测定不同浓度 PGG 的吸收峰面积 , 用 P GG 的峰面积 S 对浓度 x 做线性 回归 , 得到回归方程 S =22400x -91821, R =0. 9999, 表 明 P GG 的浓度与 其峰面积呈现良好的线 性关系。 2. 2 精密度 、 稳定性及重复性试验结果在精密度试验中 , 连续 5次测定得到 PGG 峰面积 的 RSD 为 0. 34%, 表明进样器及色谱仪精密度良好。 在稳定性及重复性 试验中 , 将浓度为 50. 0m g /L的 PGG 标准溶液在 48h 内连续测定 10次 , 测得峰形良 好

20、, RSD 为 3. 6%, 表明 PGG 溶液在 48h 内性质稳定 , 重复性良好。2. 3 不同提取方法的比较本实验分别采用 3种不同的提取剂 , 使用搅拌和 超声 2种不同方法从 RPA 和 RPR 中提取 PGG, 测得 提取率详见表 1。2. 4 回收率的测定按 1. 8方法测得 PGG 的平均回收率为 100. 9%, RSD 为 3. 57%。结果表明本实验采用的提取方法及 H PLC 测定方法可靠。表 1 不同方 法从 RPA 和 RPR 中提取 PGG 提取率的比较Tab . 1 Compar ison o f the extraction yie l d s ob t a

21、 ined from RPA and RPR by d ifferen t me t hods ( x s C h i nese herbalm ed ici ne M ethod ofextraction50%ethanolmg g -1RSD(%60%acetonem g g -1RSD(%A cet on itrile 2. 5%acetic acid mg g -1RSD (%RP A 12. 48 0. 083. 32. 32 0. 114. 62. 58 0. 124. 6 22. 11 0. 031. 32. 25 0. 041. 92. 76 0. 020. 72RPR 12.

22、 24 0. 031. 52. 41 0. 083. 42. 37 0. 014. 2 22. 32 0. 083. 32. 30 0. 041. 92. 10 0. 041. 8The extracti on yiel d i s rep res en ted as m illi gra m ofPGG per gra m ofRP A or RPR , n =3for each h erb.3 讨论本研究 参考 了 甲醇 2. 5%醋 酸 水溶 液和 乙 腈 2. 5%醋酸水溶液 2种不同流动相体系的分离效果 , 还分别比较了不同 p H 值及不同有机相比例的流动相 对 PGG 分离测定的

23、影响。结果显示 , 以乙腈 2. 5%醋 酸水溶液 (18 82, V /V,p H =2. 85 作流动相时 PGG 的峰形及分离效果最好 , 可以消除提取液中其他组分 的干扰 , 且 PGG 有较适宜的保留时间 (约为 15m i n 。 从图 1可见 PGG 与 RP A 及 RPR 中其他组分得到了 很好的分离。本实验 分 别采 用 50%乙醇、 60%丙 酮及 乙 腈 2. 5%醋酸水溶液 (30 70, V /V 3种不同的提取剂 , 并 分别使用搅 拌法和超 声法 2种不同 的提取方 法 , 从 RPA 和 RPR 中提取 PGG 的提取率结果表明 , 各种提 取方法 得到 的

24、提 取 率 差 异 没 有 统计 学 意 义 (P > 0. 05 。用乙腈 2. 5%醋酸水 溶液作提取剂 , 采用搅 拌法提取时 PGG 的提取率相对较高 , 但与其他提取 剂及提取方法比较 , 差异没有统计学意义。因而本实 验选择不良反应相对较小的 50%乙醇作为提取剂 , 采 用操作简单的超声法提取 RPA 和 RPR 中的 PGG, 并 用 H PLC 法测得 PGG 在 RPA 和 RPR 中的含量。 A 同方法 , 建立了用 H PLC 法测定 PGG 含量的方法 , 该 方法能够消除 RPA 和 RPR 中其他组分的干扰 , 操作 简单 , 测定结果精密度高、 重现性好、

25、 回收率高 , 可用 于中药提取物中 PGG 含量的测定 , 也为进行 RPA 和 RPR 中 PGG 的药理活性及其作用机制研究提供了快 速可靠的分析方法。4 参考文献1 阮金兰 , 赵钟祥 , 曾庆 忠 , 等 . 赤芍 化学 成分 和药 理作 用 的研究进展 J.中国药理学通报 , 2003, 19:965 970. 2 詹可顺 , 余南生 . 白芍 总苷 联合化 疗药 物治 疗非 小细 胞 肺癌的 临 床 研 究 J.中 国 基 层 医 药 , 2006, 13:1645 1647.3 L ee S J , Lee H K, JungM K, et a. l In v itro ant

26、iv ira l activ i ty of 1, 2, 3, 4, 6 pen ta O -g all oy l beta D g l ucose a g ai nst hepatitis B v i rusJ.Bio l Phar m Bu l, l 2006, 29: 2131 2134.4 L i Y, K i m J , L i J , et a. l N a t ural anti diabetic compound 1, 2, 3, 4, 6 penta O ga lloy l be ta D g l ucopy ranose bi nds to i nsu li n recep

27、to r and acti vates i nsuli n m ediated g l ucose transport si gnali ng path w ay J.B i o che m B iophys R es Co mmun , 2005, 336:430 437.5 R en Y, H i m me l d irk K, Chen X. Synthesi s and struct ure acti v ity re l a ti onsh i p study of anti d iabetic penta O ga ll oy l D g ,首 都 医 科 大 学 学 报 第 29

28、卷49:2829 2837.6 L i u X, K i m J K, L i Y, e t a. l T ann ic ac i d sti m u lates g l u cose transport and i nh i b its ad i pocy te d ifferen tiation i n 3T 3 L1ce llsJ.J N utr , 2005, 135:165 171.7 H uh J E , Lee E O, K i m M S , et a. l P enta O ga lloyl beta D g lucose suppresses t u m or gro w t h v i a