PTDeGFP△E250 mFoxp3融合蛋白的表达与穿膜能力鉴定

1、PTDeGFPE250 mFoxp3融合蛋白的表达与穿膜能力鉴定         11-03-24 11:56:00     编辑：studa20           作者：蔺昕 宗扬勇 许逊 田雨香 陈勋 舒新军 夏圣 王胜军 许化溪 邵启祥【摘要】  目的： 构建、表达并纯化含有蛋白转导结构域（protein transduction domain，PTD）、eG

2、FP的小鼠Foxp3突变体（PTDeGFPE250 mFoxp3）融合蛋白，为研究小鼠Foxp3的功能奠定基础。方法： 利用重叠延伸PCR方法构建pET28aPTDeGFPE250 mFoxp3原核表达载体，并在大肠埃希菌Rosetta (DE3)中表达此融合蛋白，经Ni2+柱纯化，通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察其穿膜效率。结果： 成功构建了pET28aPTDeGFPE250 mFoxp3原核表达载体，并表达和纯化了PTDeGFPE250 mFoxp3融合蛋白，流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果显示融合蛋白能很好地穿过细胞膜进入细胞内，并定位于细胞质和细胞核。结论： 成功制备了具有穿膜

3、活性的PTDeGFPE250 mFoxp3融合蛋白，为更好地研究小鼠Foxp3的功能与特性奠定了实验基础。 【关键词】  蛋白质转导结构域； Foxp3； 突变； 穿细胞膜活性    Abstract  Objective: To express and purify a mutant mouse Foxp3 fusion protein containing a protein transduction domain from TAT and an enhanced green fluorescence protein (PTDeGFPE25

4、0 mFoxp3), furthermore to investigate itss efficiency and ability  transmembrane and laid the groundwork for future research  about the function of mouse foxp3.Methods： The pET28aPTDeGFPE250 mFoxp3 vector was constructed by inserting the PCR products of mouse mutant Foxp3 into pET28aPTDeGF

5、P vector. The fusion protein was expressed by E. coli Rosetta (DE3) and purified by BioRad Profinity IMAC Nicharged Resin. The efficiency and ability of transmembrane of PTDeGFPE250 mFoxp3 were detected by FCM and confirmed by confocal microscopy.  Results： The vector of pET28aPTDeGFPE250 mFoxp

6、3 was constructed correctly and the fusion protein was expressed and purified efficiently. The results of FCM and confocal microscopy investigation indicated that PTDeGFPE250 mFoxp3 fusion protein transduce into EL4 cell efficiently. Conclusion：  The PTDeGFPE250 mFoxp3 protein can transduce int

7、o cells efficiently and may be a useful tool to study the biological functions of Foxp3.    Key words  protein transduction domain；Foxp3；mutant；transmembrane ability    CD4+CD25hi调节性T细胞(regulatory T cells，Treg) 是一群具有免疫调节功能的成熟T细胞亚群，其通过抑制潜在的自身反应性CD4+CD25-T细胞，而在自身免疫耐受

8、的形成、维持中发挥着重要的作用1。Foxp3(forkhead box P3 )属于Fox转录因子家族成员，2001年由Brunkow等首次报道2。2003年Rudensky, Ramsdel和Hori等研究小组均证明Foxp3特异性表达于CD4+CD25hiT细胞中，是Treg细胞的标志性蛋白之一，且Foxp3很大程度上决定了Treg细胞的发育和功能3-5。小鼠Foxp3蛋白结构包括N末端富含脯氨酸的结构域，中间C2H2锌指结构和亮氨酸拉链，而叉头状DNA结合域靠近蛋白C末端6。在人类中研究显示约70%发生严重的性联多内分泌腺和肠病变（immune dysregulation, polyen

9、docrinopathy, enteropathy, and Xlinked inheritance，IPEX）综合征患者存在Foxp3突变，其中错义突变大多位于C末端叉头DNA结合区域，也有少数存在于亮氨酸拉链以及N端富含脯氨酸的区域。研究显示，发生在亮氨酸结构域的缺失突变（E250）破坏了Foxp3的二聚化，并可影响Foxp3抑制功能的发挥7。    1988年Green和Franker分别发现人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type1，HIV1）编码的反式激活蛋白（transactivator transcri

10、ption，TAT）具有独特的跨膜转运作用，可以引导多种多肽和蛋白质进入细胞内8,9。1997年，Vives等10研究证明，具有转导作用的是TAT中第47至57位的11个氨基酸残基，该片段具有富含碱性氨基酸、带较多正电荷的特点，其序列为：YCKRRKRQRRR，并把该片段称为蛋白转导结构域（protein transduction domain，PTD）。PTD具有广谱的蛋白转导作用，转导速度快，效率高，可以把分子量为20120 kDa的蛋白质导入细胞内11-13。基于PTD特有的跨膜转运功能，我们利用重叠延伸PCR方法扩增第250位谷氨酸缺失的Foxp3突变体（E250），将其插入pET28

11、aPTDeGFP载体中，构建了PTDeGFPE250 mFoxp3表达质粒，在大肠埃希菌中表达PTDeGFPE250 mFoxp3融合蛋白，利用eGFP示踪技术观察融合蛋白进入细胞后的分布，并对其转导活性和效率进行了分析，为下一步的研究奠定了实验基础。    1  材料与方法    1.1  材  料    大肠埃希菌株DH5，Rosetta（DE3）均由本室保存；EL4细胞为北京大学医学部T细胞研究室陈慰峰院士赠送，pET28aPTDeGFP和pET28aPTDFoxp3质

12、粒由本室构建。核酸电泳分子量标准、低分子量标准蛋白质、rTaq DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶、限制性内切酶Hind，Xho和T4 DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒小量提取试剂盒、质粒纯化试剂盒购自上海捷瑞生物工程公司；氨苄西林、卡那霉素、IPTG购自南京建成生物公司；Profinity IMAC金属螯合填料购自BioRad公司，PD10脱盐预装柱为美国GE公司产品。    1.2  仪  器    Nikon激光共聚焦显微镜，XL2020型超声波破碎仪，FASCaliber以及CellQu

13、est软件（美国BD公司）    1.3  方  法    1.3.1  引物设计及合成  Foxp3突变体引物序列：根据基因库中小鼠Foxp3基因序列和重叠延伸PCR的实验原理(图1)，设计两对引物，由上海生工生物公司合成：    引物A：CCCAAGCTTGCATGCCCAACCCTAGGCCAGCC (划线处为Hind 酶切位点)；    引物B：CCGCTCGAGTCAAGGGCAGGGATTGGAGCAC(划线处为Xho酶切位

14、点)。    引物C：GAAAAG (CTC) AAGCTGGGAGCTATGC（括号内为定点缺失突变的碱基）；    引物D：AGCTCCCAGCTT(GAG)CTTTTCCAGC（括号内为定点缺失突变的碱基）；    1.3.2  E250 mFoxp3突变体的扩增  根据重叠延伸PCR的实验原理，分别进行三步PCR反应，以获得E250 mFoxp3突变体产物。    如图1所示，第一步PCR以构建好的pET28aPTDFoxp3质粒为模板，用引物A、

15、引物D进行扩增，获得产物AD；第二步PCR同样以pET28aPTDFoxp3质粒为模板，用引物B、C进行扩增，获得产物BC；最后以AD、BC产物为模板，用引物 A、引物B扩增产物AB（E250 mFoxp3），上述PCR产物分别用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析鉴定。    图1  重叠延伸PCR扩增示意图    Fig 1  The map of splicing by overlap extension PCR    1.3.3  E250 mFoxp3突变体产物的克隆

16、0; PCR大量扩增E250 mFoxp3突变体产物，凝胶电泳分离纯化PCR产物，用胶回收试剂盒回收目的基因，将目的基因连接到pMD18T载体上，16过夜，连接产物转化至预先制备好的大肠埃希菌感受态DH5，菌悬液均匀涂布在含氨苄西林（100 g/ml）的LB平板上，37培养过夜。    1.3.4  阳性克隆的筛选与鉴定  随机挑取平板上的单个菌落，接种于含有氨苄西林的LB培养液中，37振荡培养过夜，用小量碱裂解法小量提取质粒（命名为pMD18TE250 mFoxp3），分别以各质粒为模板进行PCR鉴定和质粒Hind ,Xho 双酶切鉴定。&#

17、160;   1.3.5  序列测定与BLAST分析  将PCR鉴定和酶切鉴定正确的阳性质粒送上海英骏公司进行测序，并在PubMed数据库中进行BLAST比对分析，确认突变位点和其余序列的正确性。    1.3.6  PTDeGFPE250 mFoxp3原核表达质粒的构建  分别将经Hind 和Xho双酶切pMDE250 mFoxp3的DNA片段和pET28PTDeGFP载体回收，以E250 mFoxp3与载体摩尔比31的比例，22连接过夜，构建pET28aPTDeGFPE250 mFoxp3原核表达载体

18、。将此质粒转化至预先制备好的大肠埃希菌感受态细胞Rosetta（DE3）菌，菌悬液涂布在含有Kan（50 mg/ml）的LB平板上，37培养过夜。按照上面的方法进行鉴定。    1.3.7  PTDeGFPE250 mFoxp3融合蛋白的表达、鉴定与纯化  将筛选出的阳性克隆菌接种于含有Kan（50 mg/ml）的LB培养液中37振摇过夜，次日按体积比为1100接种于含有Kan的新鲜LB培养液中继续培养至D(600 nm)值为0.60.8，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，30和37分别诱导2，4，6，8 h，取1 ml菌液以12 000

19、 g，离心5 min，收集菌体，取少量加入100 l PBS混悬，取20 l混悬液与20 l的2×SDS上样缓冲液混合后煮沸5 min，10 000 r/min离心10 min，进行SDSPAGE分析。    其余细菌以含8 mol/L尿素的结合缓冲液与菌体湿重之比为10 ml1 g加入结合缓冲液，冰浴中超声10×15 s裂解，离心收集上清，加入含有1 ml Profinity IMAC金属螯合填料的平衡柱，用含有10 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液洗涤，待流出液D(280 nm)趋近于0时，加入含有250 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液，收集洗脱

20、液进行SDSPAGE分析。收集的目的蛋白去盐、过滤除菌后置-80保存。    1.3.8  流式细胞仪分析PTDeGFPE250 mFoxp3融合蛋白的穿膜能力和效率  EL4细胞培养在含10小牛血清的RPMI1640培养液中，37，5CO2培养箱培养2天，收集对数生长期的细胞，Hanks洗涤2次后，计数，按照5×105/孔接种于24孔板。每孔分别加入蛋白至浓度分别为625,1 250,1 875和2 500 nmol/L，每个浓度3个复孔，分别培养2，4，6，8 h，收集细胞，4 1 500 r/min洗涤2次，最后加入500 l

21、PBS，采用流式细胞仪检测细胞内的eGFP荧光强度。    1.3.9  激光共聚焦显微镜观察穿膜蛋白在细胞内的定位  收集与640 nmol/L融合蛋白浓度共育2 h的细胞（5×105个/管），1 500 r/min离心10 min。预冷PBS洗2遍，加入0.5 ml 4%多聚甲醛固定液，缓缓悬起细胞，固定30 min。离心去固定液，用PBS洗2遍。加入PI染色液（终浓度50 g/ml），缓缓悬起细胞，4避光染色30 min，PBS洗涤。加50 l PBS，重悬细胞并滴加至载玻片上，盖上洁净的盖玻片，指甲油封片。共聚焦显微镜下观察分析。    2  结  果    2.1  PCR扩增E250 mFoxp3的结果    通过重叠延伸PCR，进行三步P