趋淋巴抗癌药丝裂霉素-右旋糖酐偶联物的合成及生物学性质的研究

1、    趋淋巴抗癌药丝裂霉素-右旋糖酐偶联物的 合成及生物学性质的研究        摘要利用右旋糖酐(T10500)局部注射后可选择性被网状上皮细胞或巨噬细胞通过胞饮作用摄取，而不会透过毛细血管壁进入血液，在体内很快被代谢，无毒无滞留的特性，将一定分子量的右旋糖酐(T77)与抗肿瘤小分子药物丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)通过一个间隔基偶联成高分子靶向抗肿瘤药物：丝裂霉素-右旋糖酐偶联物(MMC-D)，对偶联物的生物学性质进行研究，并将该偶联物用于口腔

2、癌淋巴转移的实验性研究中，实验结果说明MMC-D具有强的抗肿瘤活性，并具有明显的趋淋巴靶向性.关键词高分子靶向抗肿瘤药物；丝裂霉素-右旋糖酐偶联物；趋淋巴靶向性Synthesis of the Anticancer Drug with Affinity to LymphMMC-Dextran Conjugate and Studies on Its Biological PropertiesYan Zhongqin,Zhong Yuguo(School of Pharmacy,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)We

3、n Yuming,Qiu Chengping(College of Stomatology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)AbstractSince DextranT10500 can be uptaken by megalophage and reticulum epithelial cells,and it can not penetrate the walls of the blood capillaries into the blood,the authors designed a kind of ma

4、cromolecular anticancer drug with affinity to lymph,Drug-Dextran conjugate.This kind of conjugate is conjuation of Dextran and micromolecular anticancer agent mitomycin C(MMC)by a space.We used this conjugate in the experimental therapy of lymphatic transfer of animal oral cavity cancer.All the resu

5、lts of the tests indicated that MMC-D had strong affinity to lymph,all the same MMC-D and MMC had almost the same sensitivity to the test cells.Key wordsmacromolecular anticancer drug;MMC-Dextran conjugate;affinity to lymph转移是恶性肿瘤最重要的生物学特性之一，淋巴转移在肿瘤的转移中很常见，而且严重影响治疗效果1.近年来对淋巴转移的化疗药物研究最多的是高分子靶向抗肿瘤药物.其

6、重点在于寻找选择性更强，治疗效果更好的载药体系.在该类药物的研究中，以多糖如葡聚糖，甲壳胺作载体的很多2.这类偶联物是通过淋巴细胞特异性摄取具有一定分子大小的偶联物的特性，将偶联物浓集于靶组织区域3.由于该种偶联物具有较大的分子体积，不能透过毛细血管壁进入血液，只能被网状上皮细胞或巨噬细胞通过胞饮作用，将偶联物整体摄入细胞内，然后在酶的作用下，水解出活性物质，起到杀死肿瘤细胞的作用.因而这类高分子载体靶向药物最适于淋巴结处肿瘤或淋巴转移肿瘤的治疗，且载体本身无抗原性.丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)是一种抗肿瘤抗生素，对各种革兰氏阳性菌有强的抗菌作用.临床常用的抗肿瘤药物，其分子量

7、小，毒副作用大，不能选择性地对淋巴转移癌起作用.而右旋糖酐(T10500)能选择性地被淋巴系统摄取3，作者将小分子抗肿瘤药物MMC与右旋糖酐偶联成高分子靶向抗肿瘤药物，用于口腔癌淋巴转移的导向治疗.1合成路线设计右旋糖酐的活化、间隔基的偶联及MMC-D的合成，如1所示.Fig.1The route of synthesis2实验方法及结果仪器：岛津UV-2201紫外检测仪，LKB-2023型、85-2型磁力恒温搅拌器(上海司乐仪器厂)，LG-3型多用冰冻干燥机，PHB-4型酸度计(上海雷磁仪器厂)，2F-型三用紫外分析仪(上海硕村电光仪器厂)，P-E 983G红外测定仪，Carlo Erba

8、1106型元素分析仪，MR700型酶标仪，Coulter Epics ELite ESP流式细胞仪.药品：右旋糖酐(Dextran,T77,Sigma Chemical Co.)，溴化氰(Merck公司产品)，6-氨基己酸(上海试剂三厂)，EDC1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(上海丽珠东风生物技术有限公司)，丝裂霉素(MMC，浙江海门制药厂)，四氮唑(MTT，分析纯)，DMSO(分析纯)，PI染液.细胞：0-1V(宫颈癌细胞)，Tca8113(人舌癌细胞)，人白血癌细胞K562，高淋巴转移细胞株小鼠宫颈癌U14(中国医学科学院实验医学研究所建株，购于四川抗生素研究所药理室).R

9、PMI 1640，10%小牛血清和抗生素为培养基.成年金黄地鼠(NIH)雌雄各半(购于四川抗生素研究所).2.1丝裂霉素-右旋糖酐偶联物(MMC-D)T77的合成及鉴定将0.50 g右旋糖酐溶于50 mL注射用水中，在16条件下搅拌溶解成无色澄清的溶液，分次加入0.28 g溴化氰无色粉末，用1 mol/L氢氧化钠调pH 11.0，反应16 min后，加入0.50 g 6-氨基己酸，搅拌溶解，用1 mol/L盐酸调pH 9.0，于16条件下反应24 h，然后在4 条件下用pH 9.0的碳酸钠溶液透析3 d，至透析外液用硝酸酸化后与硝酸银反应无沉淀生成，取少许透析内液减压室温干燥.IR(KBr)c

10、m-1：3415，2932，1637，1560，1407，1014.取出透析内液，加入50 mg丝裂霉素，搅拌溶解成蓝色溶液，再加入1.00 g EDC，搅拌溶解后，用1 mol/L盐酸调pH 55.5，于16 条件下反应24 h，反应完成之后，在4 条件下用水透析3 d，至透析外液无小分子药物MMC透出，取出内液，呈紫蓝色溶液，紫外分光光法分析溶质含量=22 000(98.9%).冰冻干燥后，用Sephadex G-50柱进行色谱分析，微孔滤膜(0.65m)过滤，分装于10 mL安瓿中，相当于1.0 mg/瓶，冰冻干燥，熔封，得MMC-D冻干制剂，4 避光保存.元素分析实测值(%)：C 40

11、.97，N 6.21，H 5.78.2.2偶联物中小分子药物的含量测定取冷冻干燥后的偶联物MMC-D 11.7 mg(真空干燥24 h)，定容到50.0 mL水溶液，紫外364 nm处测定其含量为6.67%(w/w,相当于MMC的含量).2.3体外药敏实验2.3.1MTT法测定MMC-D对癌细胞的敏感性4将培养48 h的细胞分别接种至96孔板内，每孔接种10 000个细胞(100 L接种后扩增，待孔板内长满细胞为止)，共六板.于每板上的每种细胞中加入不同浓度的二种药物各100 L/孔，药物浓度为：0.025，0.125，0.25，1.25，2.5，25，50 g/mL.然后于37 ，5%二氧化

12、碳的孵箱中培养，加入药物后第1，2，3，4，5，6 d终止药物反应，加入MTT(20 L/孔)，2 h后去掉反应混合液，再加入DMSO，振摇10 min，显紫色，于酶标仪上测定光密度(OD).即可测出相当于活细胞的数目值.经计算机EXCEL程序数据处理，比较50 g/mL的MMC，MMC-D二种药物分别对0-1 V，Tca8113两种细胞的作用强弱，结果见表1.Tab.1OD values tested by MTT assaySampleO-1VTca8113Time/dTime/d123456123456MMC(50 g/mL)0.45100.61400.40750.37700.30300

13、.17200.63900.81400.53200.46000.45800.2235MMC-D(50 g/mL)0.51400.62600.47200.59950.47850.26750.67800.82500.81900.88800.52600.4260MTT法药敏实验结果表明：MMC，MMC-D二种药物对鳞癌细胞均有一定的杀伤作用，其中MMC-D的药效稍低于MMC，且起效较MMC慢，可能是由于MMC-D在体内有一水解过程，但持效长.2.3.2应用流式细胞仪测定法测定MMC，MMC-D对白血癌细胞K562的敏感性5取对数生长的白血癌细胞K562置于24孔板(200 000个/孔)，每孔体积1.

14、0 mL，共8孔.每孔分别编号，并于每孔分别加入浓度为0.5 mg/mL的药液10，30，50 L，共2种药物(MMC-D，MMC)于37，5%二氧化碳的孵箱中孵育48 h.在显微镜下观察细胞生长情况，有成团或浮起的细胞，有的细胞核固缩，碎裂.将细胞培养板取出，用滴管吹打数次，使细胞最大程度游离，将每孔的细胞悬液尽可能全部地转移到流式细胞仪专用试管中，一一对应并编号，以1 800 r/min离心5 min，倾去上清液，试管底部留下细胞，于每管中加入0.8 mL的PI染液，染色30 min，待测定.用流式细胞仪进行细胞凋亡和生长周期变化分析，结果见表2和表3. Tab.2The percenta

15、ge(%) of apoptosis cells in total K562 cellstreated by different concentrations of MMC and MMC-D at different timeControlMMCMMC-DConcentration/g.mL-1Concentration/g.mL-151525515254.430.639.445.527.235.744.0Tab.3The effects of different concentrations ofMMC and MMC-D on the growth period of K562 at d

16、ifferent timeSampleConc./g.mL-1The percentage of every growth period/%G1G2Scontrol50.914.634.4550.04.445.6MMC1561.33.235.42569.91.029.1538.33.558.3MMC-D1552.15.941.92559.32.238.5表2和表3显示MMC和MMC-D均对癌细胞K562有较强的凋亡诱导作用，对癌细胞的生长周期影响也相当大，且都有浓度依赖性.MMC-D的生物活性比MMC略低，但仍保持强的活性.这一结果与MTT法对MMC-D的药敏性实验结果一致.2.4趋淋巴性研究

17、2.4.1微生物测定法确定MMC-D的效价6用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis 63501)作试验菌，制备合格的枯草芽孢杆菌悬液，取0.3%悬液5 mL加入含有培养基20 mL的双碟中，以等距离安置不锈钢管4枚，分别滴加不同浓度的MMC和MMC-D，加入药物后于37培养1618 h，量取抑菌圈直径大小，效价按抗生素检测法二剂量公式计算，得出1 g MMC-D相当于0.115 g的MMC.2.4.2小鼠体内药物分布试验在已建立的成年金黄地鼠(NIH)颈淋巴转移小鼠宫颈癌U14细胞的模型中，选择30例，分3个时间段即分成三组，每组10只，每两只小鼠的血和淋巴分别结合成一个样本，在

18、双颊部肿瘤瘤周给药MMC-D 0.2 mg(相当于MMC的含量)，注射后12，24，48 h断颈处死，摘眼球取血，留取淋巴结，称重.另取淋巴结送光镜检测.对照组12只NIH小鼠尾静脉注射0.1 mg MMC，注药后12，24，48 h断颈处死，同法留取样本.取6只NIH正常小鼠，不给药，作阴性对照.在装有培养基的平皿内接种枯草杆菌63501，待菌体铺满培养基表面后放入钢杯，在杯内分别加入淋巴结组织生理盐水匀浆(1 mL/g)上清液和小鼠血浆离心上清液，37 孵育1618 h后，测定培养基表面枯草杆菌抑菌环直径大小，根据其生物活性效价换算成淋巴结和血浆中药物浓度，进行统计分析处理.淋巴结中药物浓

19、度见表4，在血浆中各时间段的样本以及对照组淋巴结样本中均未检测出药物. Tab.4The concentrations of MMC-D in the lymph node of mice with U14g/gGroupTime/hGroupTime/h122448122448137.5228.7321.32435.3527.3222.47233.4329.5220.54530.4728.4519.39330.2929.2119.05P0.01 该生物检测方法的最低检测限度为3.8 g/g组织，因此可以得出淋巴结内药物浓度比血液中的药物浓度至少高6倍以上.即MMC-D较MMC具有高的亲淋巴性

20、.3讨论3.1MMC-D的合成，是采用溴化氰活化法7，8.溴化氰是一种强的氰化剂，活性很高，因此活化温度不宜过高，试验发现温度偏高(高于23)，活化过快，活性物质极易失活，温度偏低(低于4)，生成的活性物质在水中的溶解性降低.经过多次试验发现反应温度为16最好.活化时间也不易过长，活化时间过长(超过30 min)，活性物质失活，偶联率降低，试验发现反应在816 min较好.3.2测定肿瘤化疗药物敏感性的方法有多种.最近发现许多化疗药物均能诱导敏感细胞发生凋亡10.目前国内外检测凋亡最准确的方法是流式细胞仪和DNA琼脂糖电泳.作者运用流式细胞仪测定法对偶联物MMC-D的冻干制剂对细胞K562的敏

21、感性进行测定.流式细胞仪测定法能更客观地反映肿瘤细胞药物作用后的功能和形态学变化特征，同时还能观察药物不同浓度在不同时间引起肿瘤细胞动态变化特征以及分析药物对细胞的生长周期的影响，较MTT法能更客观、更准确地反映药物对细胞的敏感性.3.3MMC为抗菌素类非特异性抗肿瘤药物，既具有抗癌作用，还具有抗菌作用.因此可以通过药物对细菌抑菌环的大小来间接测定血浆和淋巴组织中的药物浓度.试验结果显示，局部给MMC-D后，小鼠颈淋巴结内药物浓度较血浆中至少高6倍以上，该结果支持了作者对趋头颈部淋巴抗肿瘤药物的设计思想.同时由于MMC-D的体内半衰期大于24 h，因此设计的取标本的时间段较长.而MMC的半衰期为8 min，在预试中发现MMC静注动物体内后30 min以内，颈淋巴结中仍然没有检测出药物.因此所选时间段对MMC基本不受其半衰期的影响.作者简介：严忠勤通讯联系人作者单位：严忠勤钟裕国华西医科大学药学院，成都 610041温玉明邱成平华西医科大学口腔医学院颌面外科，成都 610041参考文献1郑家伟，陈宝勇.国外医学肿瘤分册.1995，22(6)：3433452Hasnida M,Takakura Y,Matsumo S,et al.Regeneration characteristics in relation to its activit