趋骨性雌二醇煅烧骨复合物对兔桡骨临界性缺损的修复效果

1、趋骨性雌二醇/煅烧骨复合物对兔桡骨临界性缺损的修复效果         10-05-03 16:54:00     编辑：studa20           作者：赵强，齐进，李国松，王晋申，钱念东，周琦，魏义勇，邓廉夫【摘要】  目的以锻烧成分颗粒骨为载体，构建趋骨性雌二醇/煅烧骨复合材料，评价其修复兔桡骨临界性缺损的优势性能。方法建立兔桡骨中段15 mm临界性骨缺

2、损模型，随机分为3组。空白对照组：骨缺损处不放置任何植入物;锻烧骨组：骨缺损处植入锻烧骨;复合材料组：骨缺损处植入趋骨性雌二醇/煅烧骨复合物。术后8周，应用影像学、组织学和Micro-CT等方法检测桡骨缺损处的骨修复情况。结果空白对照组骨缺损处无明显的新骨形成;煅烧骨组骨缺损处有少量的新骨形成;SE2/煅烧骨复合物组骨缺损处有大量的新骨形成，在放射学上及生物力学上均较好的修复了兔桡骨临界性缺损。结论局部应用趋骨性雌二醇可以促进新骨的形成并有利于骨缺损的修复。 【关键词】  趋骨性雌二醇; 锻烧骨; 生物材料; 临界性骨缺损Abstract: ObjectiveTo evaluate

3、the potential efficacy of a complex of a new bone-seeking estragen (SE2) and true bone ceramics (TBC) for enhancing healing of critically sized segmental defects in rabbit radii. MethodCritically sized radialis defects were created in the forelimbs of New Zealand white rabbits,which were randomized

4、into three groups.In control group,the bone defect was lefe blank.In TBC group,the bone defect was filled with true bone ceramics.And in SE2 group,the defect was filled with a complex of 0.8 mg bone-seeking estradiol and true bone ceramics.After 8weeks,radiological,histomorphometric and biomechanica

5、l evaluations were performed to evaluate osteogenesis of the bone-seeking estradiol.ResultNo defect healing was found in the control group and only a small amount of bone formation was found after implantation of single TBC.In contrast,more new bone was found in the SE2 group.The critical size bone

6、defect was not only radiologically,but also mechanically healed 8 weeks after implantation of the complex of bone-weeking estradiol and true bone ceramics.ConclusionOsteogenesis can be promoted by bone-seeking estradiol,which is an appropriate tool to induce bone healing in atrophic nonunion.Key wor

7、ds：bone-seeking estrogen; true bone ceramics; biomaterial; critical-size bone defect采用生物学增援的措施促进骨修复是长期以来努力探索的内容13。在既往的研究中，作者通过对大量合成性小分子化合物在骨组织中的分布和代谢等特征的分析与检测，筛选并发现胺素类化合物具有与Ca2+螯合的特性而呈现亲骨性，其中以亚氨基二乙酸NH(CH2COOH)2，SF的趋骨性能较为明显。以结构优化修饰后的SF为先导化合物，与17-雌二醇(E2)分子相键合，形成趋骨性雌二醇结构体(SE2);以SF为先导可使E2导入并浓集于骨组织中。E2具有

8、刺激成骨细胞前体细胞向成骨细胞转化，增强成骨细胞表型表达，促进骨形成的药效作用4、5。本实验将以富含Ca2+等无机组分的煅烧成分颗粒骨为载体，利用SF能与Ca2+整合并随煅烧骨颗粒降解而逐步解离的特性，制成既可使E2浓集、缓释，又有一定填充、支撑效果的SE2/煅烧骨复合物骨修复材料，植入兔桡骨临界性骨缺损处，进一步评价其骨修复效果。1 材料和方法1.1 煅烧骨的制备取新鲜成年牛股骨下端或胫骨上端松质骨处完整骨块，去除骨膜及皮质骨，切割成5 mm×5 mm×15 mm大小的松质骨块。沸水中煮沸10 h，然后分别在1%NaOH和30%H2O2中浸泡1 h以脱脂脱蛋白;双蒸水冲洗

9、后，置70恒温箱内干燥72 h，再于马弗炉中分两步煅烧：首先温度缓慢(时间不少于60 min)上升至600，维持35 h，在此之后温度缓慢(不少于3 h)上升至1 100，维持3 h6。自然降温后取出，高压蒸汽灭菌备用。随机取部分样本进行检测。1.2 SE2与煅烧骨的复合12 mg SE2(纯度99%，委托中国科学院上海药物研究所合成)用2 250 l无水乙醇溶解，过滤除菌。无菌条件下，用吸管将150 l SE2溶液分别均匀注入每一煅烧骨条块孔隙内，使每一煅烧骨条块内含有的0.8 mg SE2(剂量选择由预实验获得)。将加入SE2溶液的煅烧骨块置于冷冻干燥机中(LABCONCO，美国)，真空抽

10、吸30 min，无水乙醇完全挥发后，SE2即均匀附着于煅烧骨的腔隙表面，形成SE2/煅烧骨复合物。1.3 兔桡骨临界骨缺损动物模型的建立18只成年雄性新西兰大白兔(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司)，体重2.53.0 kg。2.5%戊巴比妥纳(1 ml/kg)麻醉，俯卧位固定四肢。在双前臂前内侧做3 cm的纵型切口，牵拉肌肉暴露桡骨。生理盐水冲洗下，用摆锯在桡骨中段做一长15 mm的节段性缺损，其两断端分别剥离5 mm的骨膜。36侧桡骨于缺损模型随机分为3组，每组12侧(n=12)，即空白对照组：桡骨缺损处无任何植入物;煅烧骨组：桡骨缺损处植入单纯煅烧骨块;SE2组：桡骨缺损处植入SE2/煅

11、烧骨复合物。术中注意保护尺骨，截骨处不作固定。缝合皮下组织和皮肤。动物分笼、常规饲养，自由活动。于术前30 min、术后第13 d肌肉注射盐酸庆大霉素(10 000 u/kg)以预防感染。术后当日拍摄X线片(GE9 800，美国)以了解造模的情况。1.4 观察指标术后2周、4周、8周分别行X线片以评价桡骨缺损处的修复情况。于造模后第8周，获取桡骨标本，应用micro-CT(Lotus SP，美国)三维重建桡骨缺损模型处的形态图像，计量分析骨形成指标，包括骨密度(BMD)以及结构参数等。取造模后第8周桡骨标本，室温下丙酮固定6 h，聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)包埋。硬组织切片机(EXKAT，德国

12、)切片，甲苯胺兰染色。显微镜下(Olympus AH-2，日本)观察骨缺损模型处新骨形成情况。分别于桡骨缺损处的近1/3、中1/3和远1/3处，各选取1张硬组织切片，分4个象限，采用连有Leica Qwin计算机图像分析软件的显微镜，对每个象限的新生骨进行图像处理分析，分别计算煅烧骨组、SE2/煅烧骨复合物植入组的平均新生骨面积的百分比。于动物处死前第13 d、第3 d分别肌肉注射四环素(25 mg/kg)7。取造模后的第8周的桡骨缺损处的标本，硬组织切片，落射荧光显微镜下观察四环素荧光标记的新骨形成情况。取造模后第8周的SE2/煅烧骨复合物植入组标本，应用X射线聚焦荧光能谱仪(Eagle，美

13、国)测量骨缺损处新生骨组织的无机成分含量及其钙/磷比率，并与相应兔正常桡骨的钙磷元素比例相比较。术后8周，煅烧骨组和SE2组各6侧兔桡骨植入物标本，剔净软组织，使用3点弯曲法进行生物力学分析。生物力学测试仪(Instron，美国)，加载速度为1 mm/min，变形测量精度0.12 m，载荷测量精度0.5%，设定最大压力负荷为1 000 N。1.5 统计学分析应用SAS 6.12统计软件包进行统计学分析。各组实验资料统计量以均数±标准差表示(x-±SD)。两组间数据的统计学比较采用团体t检验分析，P<0.05具有统计学意义。2 结果2.1 煅烧成分颗粒骨的形态及其无机成

14、分的含量煅烧骨呈白色，质脆，具相互连通的多孔网状结构，孔隙率为85%，孔径大小250450 m，孔径大于300 m的占96%(图1ac)。X射线聚焦荧光能谱仪分析显示，煅烧骨钙磷原子数量比为1.67±0.21(图1d)，接近于兔骨膜骨的钙磷比值8。2.2 造模后实验动物的一般情况术后动物伤口愈合良好，无红肿等感染征象。术后第1 d，动物双前肢可站立，3 d后恢复正常活动。实验过程中动物无死亡，无局部和全身并发症的发生，活动及进食正常，各实验兔体质量均无明显减轻。2.3 桡骨标本的大体观察动物于造模后第8周末，静脉注射过量戊巴比妥钠处死后分离并获取桡骨标本。大体观察下，在无填充物(即空

15、白对照组)的桡骨骨缺损处，桡骨断端萎缩，骨缺损明显，由软组织填充(图2a);植入单纯煅烧骨(即煅烧骨组)的桡骨骨缺损处，植入物部分降解，与断端界限尚清晰，表面粗糙不平，质较硬(图2b);植入SE2/煅烧骨复合物(即SE2组)的桡骨骨缺损处，植入物与桡骨远近侧断端之间愈合牢固，植入体表面光滑平整，质硬(图2c)。     10-05-03 16:54:00     编辑：studa202.4 骨缺损处的X线片的图像变化手术后随时间推移，空白对照组桡骨断端逐渐吸收萎缩，骨缺损明显，缺损处无新骨形成(图3a);煅烧骨组植

16、入物密度缓慢增加，8周时骨缺损未完全填充修复，植入物可见部分降解吸收，植入物与桡骨断端还可见有空隙存在(图3b);而SE2组随时间推移，植入物密度明显增加，8周时缺损处大量新骨形成，植入物已与桡骨断端完全骨性愈合，但骨髓腔尚未贯通(图3c)。 图1煅烧骨及其钙磷比例分析 图1a大体标本 图1b扫描电镜图像，呈现天然的高密度孔隙网架结构(×30) 图1c扫描电镜图像局部放大，可见孔隙间相互交通(×150) 图1dX射线聚焦荧光能谱仪检测煅烧骨钙磷原子数量比值 图28周时各组兔桡骨的大体标本 图2a空白对照组 图2b煅烧骨组 图2cSE组 图3X线检测结果 图3a空白对照组，骨

17、缺损未修复 图3b煅烧骨组，骨缺损部分修复图3cSE2组，骨缺损完全修复2.5 桡骨骨缺损修复过程的组织学变化造模后第8周，植入SE2/煅烧骨复合物(即SE2组)的桡骨缺损处，显微镜下可见植入物与桡骨断端融为一体;煅烧骨材料的表面和内部均有大量的新生骨形成，以板层骨为主，融合成片，并相互连接成网状。空隙内新生骨呈同心圆状排列，形成典型的骨单位。部分煅烧骨材料被分割降解，由新生骨替代(图4a1)。煅烧骨组仅材料空隙边缘有少量新生骨岛形成，以软骨和编织骨为主，排列紊乱，板层骨量少，散在分布(图4a2)。SE2组和煅烧骨组平均新生骨面积百分比分别为0.738±0.0 861和0.197&#

18、177;0.0 715，两组之间有显著性差异(P<0.01)(图4c)。荧光显微镜下，SE2组硬组织切片可见清晰、金黄色的四环素双荧光标记带，两条荧光带之间为10 d时间内新骨的形成量，显示新骨形成活跃(图4b1)。而单纯煅烧颗粒骨植入组四环素双荧光标记带不明显，表明新生骨形成相对不活跃(图4b2)。2.6 骨形成的CT评价8周时，SE2组植入物质地致密，边缘和中央均有明显的新骨形成，但骨髓腔尚未贯通。而煅烧骨组植入物结构疏松，部分煅烧骨被吸收，新骨形成相对较少(图5)。对骨形成的计量分析发现，SE2组植入物的BMD、小梁厚度(Tb.Th)、小梁数量(Tb.N)比煅烧骨组分别增加61.7

19、5%、41.92%、41.49%，而小梁间距(Tb.Sp)下降了34.56%(图6ad)。2.7 SE2组新生骨钙磷原子比例X射线聚焦荧光能谱仪测量SE2组硬组织切片中新生骨的钙磷原子数量比例为1.749±0.29，与兔正常桡骨(1.755±0.38)无显著性差异(P>0.05)(图6e)。2.8 SE2组植入物力学强度显著增加煅烧骨组和SE2组各6侧兔桡骨植入物最大载荷通过3点弯曲方法进行了生物力学分析。SE2组的平均最大载荷为206.15±53.71(N)，比煅烧骨组有显著的增加(82.69%，P<0.05) (图6f)。 图48周时植入物组织学切

20、片及新生骨面积百分比分析 图4a植入物不脱钙组织切片(甲苯胺兰染色) 图4a1SE2组，煅烧骨空隙中有大量新骨形成 图4a2煅烧骨组，仅煅烧骨空隙边缘有少量新骨形成。白色箭头所指为新生骨组织，黑色箭头所指为煅烧骨材料图4b趋骨性荧光素(四环素)标记组织切片 图4b1SE2组,白色箭头所指为四环素双荧光标记带 图4b2煅烧骨组，四环素双荧光标记带不明显 图4c组织切片中新生骨面积百分比统计分析(*P<0.01 vs TBC) 图58周时植入物Micro-CT三维重建(上)及横断面图像(下) 图5aSE2组 图5b煅烧骨组3 讨论评价骨诱导生长因子或生物载体材料促进节段性骨缺损修复的动物实验

21、中，应使用不能自然愈合的骨缺损模型，可通过切除足够长度骨质来阻止骨的自然愈合。Johnson等指出9，骨缺损超过骨干直径的34倍，骨缺损即不能自然愈合，这种不能自然愈合的最小尺寸骨缺损即临界性骨缺损。作者的实验采用了兔桡骨临界性缺损模型，将兔桡骨截除15 mm的同时去除骨膜，并切除骨缺损处远近断端各5 mm骨膜，进一步消除了骨外膜成骨的因素。造模后8周，空白对照组桡骨缺损处无新骨形成，而由软组织填充，表明作者制作的兔桡骨缺损模型在无外界干预的情况下不能自然愈合，符合长骨临界性骨缺损的要求。另外，由于兔尺、桡骨可以相互作为内在的夹板保持单根骨部分缺损后前臂的相对完整而不需要额外的固定，使得兔桡骨

22、缺损模型的制作更为简便。本实验中作者采用煅烧骨作为携带的SE2载体。煅烧骨多以成年牛松质骨为原料，经脱脂、脱蛋白并高温煅烧得到，是一种主要含有钙磷的有组织的晶体。通过冷冻负压抽吸干燥作用使SE2均匀分布于煅烧骨腔隙的表面，一方面，SE2具有趋骨性，可以聚集在骨组织发挥作用，另一方面SF可以和其中的钙盐螯合使得SE2“锚固”于煅烧骨表面而不易脱落，而且煅烧骨在体内可缓慢地降解吸收，导致与其结合的SE2不断缓慢释放，从而构成SE2的缓释系统，使得SE2不需其它的缓释装置即可以在骨缺损局部持续地起作用。雌激素可以刺激成骨细胞前体细胞向成骨细胞转化，增强成骨细胞碱性磷酸酶的活性并促进骨钙化结节的形成。

23、骨折愈合过程中骨痂组织雌激素受体的表达也表明雌激素对骨折修复中细胞的分化和软骨的钙化起到重要作用10。通过对兔桡骨临界性缺损的修复实验，作者对煅烧骨和SE2/煅烧骨复合物的成骨能力进行了全面的衡量。兔桡骨临界性缺损处单纯植入煅烧骨，8周后组织学切片显示，煅烧骨材料的边缘有部分新生骨组织，散在分布，不能包绕或覆盖煅烧骨材料，说明新生骨组织与煅烧骨材料的关系不密切，而植入物中央无明显新骨形成，说明煅烧骨中的成骨是依赖于局部微环境中的成骨因素。植入物的骨密度、小梁厚度和数量均与SE2/煅烧骨复合物组有明显的差异。四环素标记显示无明显的双荧光标记带，表明新生骨形成不活跃。这说明单独使用煅烧骨颗粒修复临界性骨缺损时，新生骨的形成相对比较缓慢，因此，治疗大段性骨缺损还应增加使用其它促进骨形成的因子。而SE2组在植入SE2/煅烧骨复合物2周时，影像学上即出现植入物局部密度增高，显示有新骨形成反应。8周时可见植入物与新生骨组织之间相互包容，整合良