胚胎先天性神经管缺陷的表达差异基因及信号传导

1、胚胎先天性神经管缺陷的表达差异基因及信号传导 09-09-27 15:53:00 编辑：studa20 作者：马向东,吴小明,马兴,赵东涛,陈必良,辛晓燕,王德堂【摘要】 目的： 研究妊娠合并糖尿病诱发胚胎先天性神经管缺陷的分子机制. 方法： 将29只SD雌性大鼠分为3组： 正常对照组，8只； 实验模型组，链脲佐菌素(STZ)构建的妊娠合并糖尿病诱发胚胎先天性神经管缺陷，12只； 实验对照组，STZ构建的糖尿病大鼠模型但胚胎不伴有先天性神经管缺陷发生，9只. 于妊娠第12日取出各组胚胎，解剖显微镜下进行形态学分析. 提取卵黄囊细胞mRNA，用cDNA基因芯片技术对表达差异基因进行检测. 提取卵

2、黄囊细胞蛋白质，应用特异性抗磷酸化抗体进行免疫共沉淀及Western Blot，对MAP Kinase信号途径上各蛋白激酶活性进行分析. 结果： 提取实验模型组大鼠胚胎卵黄囊细胞mRNA，与正常对照组大鼠胚胎卵黄囊细胞mRNA共1200个基因同时进行比较，共筛选出表达差异基因79条，其中42条表达上调基因，包括凋亡相关基因BAX，bcl2，heat shock 70，glucosetransporter 3等；37条表达下调基因包括phospholipase A2，insulinlike growth factor receptor等. 与正常对照组相比较，ERK1/2蛋白激酶活性显著下降；J

3、NK1/2活性明显升高，凋亡相关蛋白Caspase3，Bax高表达，凋亡抑制蛋白AKT活性明显受抑. 结论： 妊娠合并糖尿病诱发的胚胎先天性神经管缺陷的发生，与MAP Kinase及细胞凋亡信号传导机制参与密切相关. 【关键词】 cDNA；基因芯片；神经管缺陷；糖尿病；MAP kinase；细胞凋亡 0引言 妊娠合并糖尿病孕妇的胎儿(infants of diabetic mothers，IDM)重要器官先天性畸形的发生率高达 610，并直接导致50的围产儿死亡率. 其中，高血糖内环境引起的胚胎先天性神经管缺陷的复杂病因，包括脂质、蛋白质代谢失调及超氧阴离子自由基的作用，引起胚胎卵黄囊细胞膜基

4、本脂质成分缺失等原发性损伤1，表现出细胞信号传导的变化. 我们应用cDNA基因芯片技术2，对大鼠胚胎卵黄囊细胞1200个基因表达差异基因mRNA进行检测，旨在筛选参与先天性神经管缺陷发生的表达差异基因，并在此基础上深入揭示参与其发生的信号传导机制. 1材料和方法 1.1材料雌性SD大鼠29只，鼠龄7090 d，体质量250300 g （第四军医大学实验动物中心），与同种系的SD雄性大鼠交配后常规培养于动物中心. 链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(美国Sigma公司)；总RNA标记和纯化试剂盒(Clontech, #K1038)；cDNA探针(AltlasTM cDNA Exp

5、ression Arrays, Clontech, #PT31401). 1.2方法1)，经反转录酶和32PdATP于50标记探针25 min. 经提取、纯化试剂盒洗脱未标记的探针，测量标记cDNA探针的放射性同位素的量.1)尼龙杂交膜，包括1200个基因的cDNA 杂交点，9 个看家基因作为阳性对照. 探针于68预杂交30 min，应用杂交液和鲑精DNA在尼龙膜上68杂交过夜，严格洗涤膜，-80 Kodark Xray胶片压片3 7 d. 扫描杂交信号后经AtlasImage 1.01软件(Clontech)分析结果. 09-09-27 15:53:00 编辑：studa20 统计学处理：采

6、用t检验分析. 2结果 2.1cDNA基因芯片技术筛选表达差异基因对先天性神经管缺陷大鼠卵黄囊细胞mRNA与正常对照组中共1200个基因同时进行比较,两组中共筛选出表达差异基因79条（图1）. 其中42条表达上调基因，包括凋亡相关基因BAX，bcl2，heat shock 70，glucosetransporter 3等；37条表达下调基因，包括phospholipase A2，insulinlike growth factor receptor等. 2.2信号传导蛋白激酶活性分析 2.3细胞凋亡相关蛋白Caspase3，Bax活性分析在实验模型组中，细胞凋亡相关蛋白Caspase3，Bax活

7、性较正常对照组明显升高(P0.05，图5，6). 3讨论 应用cDNA基因芯片技术，对胚胎卵黄囊细胞1200个基因同时进行比较，筛选出妊娠合并糖尿病诱发胚胎先天性神经管缺陷卵黄囊细胞表达差异基因79条：其中42条表达上调基因，包括凋亡相关基因BAX，bcl2，heat shock 70，glucosetransporter 3等；37条表达下调基因，包括phospholipase A2，insulinlike growth factor receptor等. 在先天性神经管缺陷卵黄囊细胞42条表达上调基因中，包括HSP70，GLUT3，而IGFR2 mRNA水平显著下调. 高血糖引起卵黄囊细胞

8、ET1基因表达上调，以及PHGP活性升高，提示高血糖内环境及超阳阴离子自由基可能引起胚胎卵黄囊细胞的损伤，与先天性神经管缺陷的发生有关. 神经管缺陷等胚胎畸形的形成，常伴随多种神经生长因子和生长因子的异常表达，我们检测出NGF表达上调3，Lim2 mRNA，HGF mRNA，PDGF的表达下调4以及生长因子水平的改变，是对高糖和超阳阴离子自由基引起的胚胎损伤的反应和调节. 高血糖引起的卵黄囊细胞膜损伤，与基本脂质成分的代谢异常密切相关，包括花生四烯酸、肌脂等. 花生四烯酸水平与前列腺素酶PLA2(phospholipase A2)活性改变有关5. cDNA基因芯片技术发现，糖尿病组胚胎卵黄囊细

9、胞基因组中PLA2 mRNA 信号强度明显减弱，可能导致脂肪酸代谢缺陷. 神经管缺陷的胚胎卵黄囊细胞中磷酸化的ERK1/2活性明显降低5-6. 与此相反，JNK1/2活性在实验模型组却显著升高7. 这种活性变化提示，高血糖状态通过RafMEKERK信号途径调控卵黄囊细胞的基因表达方式对胚胎的发育产生影响. 凋亡相关基因Caspase3明显高表达，激活下游的Bax基因表达参与细胞程序化死亡，同时，神经管缺陷胚胎卵黄囊细胞中，凋亡抑制蛋白AKT蛋白激酶活性明显受抑，通过网络调控促进卵黄囊细胞凋亡参与神经管缺陷的发生8-9，对妊娠合并糖尿病诱发的胚胎神经管缺陷分子机制的深入研究，对揭示其分子病因学、

10、探讨有效的预防和治疗具有重要意义.【参考文献】 1 Reece EA. In the search for genes responsible for neural tube defects, glucose metabolism mattersJ. Reprod Sci,2008,15:7-8.2 Reece EA, Ji I, Wu YK, et al. Characterization of differential gene expression profiles in diabetic embryopathy using DNA microarray analysisJ. Am J

11、Obstet Gynecol, 2006,195:1075-1080.3 Bennett GD, Wlodarczyk B, Calvin JA, et al. Valproic acidinduced alterations in growth and neurotrophic factor gene expression in murine embryosJ. Physiology,2007,22:380-390.4 Trovato M, DArmiento M, Lavra L, et al. Expression of p53/HGF/cmet/STAT3 signal in fetu

12、ses with neural tube defectsJ. Virchows Arch, 2007,450:203-210.5 Reece EA, Ma XD, Wu YK, et al. Aberrant patterns of cellular communication in diabetesinduced embryopathy I: Membrane signalingJ. J Mater Fetal Med, 2002,11:249-253.6 马向东,陈必良,辛晓燕,等. 妊娠合并糖尿病诱发胚胎先天性神经管缺陷的MAP激酶及细胞凋亡信号传导机制J. 现代妇产科研究进展, 200

13、3,12:324-326.7 Yang P, Zhao Z, Reece EA. Blockade of cJun Nterminal kinase activation abrogates hyperglycemiainduced yolk sac vasculopathy in vitroJ. Am J Obstet Gynecol, 2008,198:321-327.8 Reece EA, Ma XD, Zhao ZY, et al. Aberrant patterns of cellular communication in diabetesinduced embryopathy :

14、Apoptotic pathwaysJ. Am J Obstet Gynecol, 2005,192:967-972.9 陈必良,马向东,马兴,等. 妊娠合并糖尿病诱发胚胎先天性神经管缺陷细胞凋亡信号转导的初步研究J. 中国神经免疫学和神经病学杂志,2005,12:304-307. 09-09-27 15:53:00 编辑：studa20 统计学处理：采用t检验分析. 2结果 2.1cDNA基因芯片技术筛选表达差异基因对先天性神经管缺陷大鼠卵黄囊细胞mRNA与正常对照组中共1200个基因同时进行比较,两组中共筛选出表达差异基因79条（图1）. 其中42条表达上调基因，包括凋亡相关基因BAX，b

15、cl2，heat shock 70，glucosetransporter 3等；37条表达下调基因，包括phospholipase A2，insulinlike growth factor receptor等. 2.2信号传导蛋白激酶活性分析 2.3细胞凋亡相关蛋白Caspase3，Bax活性分析在实验模型组中，细胞凋亡相关蛋白Caspase3，Bax活性较正常对照组明显升高(P0.05，图5，6). 3讨论 应用cDNA基因芯片技术，对胚胎卵黄囊细胞1200个基因同时进行比较，筛选出妊娠合并糖尿病诱发胚胎先天性神经管缺陷卵黄囊细胞表达差异基因79条：其中42条表达上调基因，包括凋亡相关基因B

16、AX，bcl2，heat shock 70，glucosetransporter 3等；37条表达下调基因，包括phospholipase A2，insulinlike growth factor receptor等. 在先天性神经管缺陷卵黄囊细胞42条表达上调基因中，包括HSP70，GLUT3，而IGFR2 mRNA水平显著下调. 高血糖引起卵黄囊细胞ET1基因表达上调，以及PHGP活性升高，提示高血糖内环境及超阳阴离子自由基可能引起胚胎卵黄囊细胞的损伤，与先天性神经管缺陷的发生有关. 神经管缺陷等胚胎畸形的形成，常伴随多种神经生长因子和生长因子的异常表达，我们检测出NGF表达上调3，Lim

17、2 mRNA，HGF mRNA，PDGF的表达下调4以及生长因子水平的改变，是对高糖和超阳阴离子自由基引起的胚胎损伤的反应和调节. 高血糖引起的卵黄囊细胞膜损伤，与基本脂质成分的代谢异常密切相关，包括花生四烯酸、肌脂等. 花生四烯酸水平与前列腺素酶PLA2(phospholipase A2)活性改变有关5. cDNA基因芯片技术发现，糖尿病组胚胎卵黄囊细胞基因组中PLA2 mRNA 信号强度明显减弱，可能导致脂肪酸代谢缺陷. 神经管缺陷的胚胎卵黄囊细胞中磷酸化的ERK1/2活性明显降低5-6. 与此相反，JNK1/2活性在实验模型组却显著升高7. 这种活性变化提示，高血糖状态通过RafMEKE

18、RK信号途径调控卵黄囊细胞的基因表达方式对胚胎的发育产生影响. 凋亡相关基因Caspase3明显高表达，激活下游的Bax基因表达参与细胞程序化死亡，同时，神经管缺陷胚胎卵黄囊细胞中，凋亡抑制蛋白AKT蛋白激酶活性明显受抑，通过网络调控促进卵黄囊细胞凋亡参与神经管缺陷的发生8-9，对妊娠合并糖尿病诱发的胚胎神经管缺陷分子机制的深入研究，对揭示其分子病因学、探讨有效的预防和治疗具有重要意义.【参考文献】 1 Reece EA. In the search for genes responsible for neural tube defects, glucose metabolism matter

19、sJ. Reprod Sci,2008,15:7-8.2 Reece EA, Ji I, Wu YK, et al. Characterization of differential gene expression profiles in diabetic embryopathy using DNA microarray analysisJ. Am J Obstet Gynecol, 2006,195:1075-1080.3 Bennett GD, Wlodarczyk B, Calvin JA, et al. Valproic acidinduced alterations in growth and neurotrophic factor gene expression in murine embryosJ. Physiology,2007,22:380-390.4 Trovato M, DArmiento M, Lavra L, et al. Expression of p53/HGF/cmet/STAT3 signal in fetuses with neural tube defectsJ. Virchows Arch, 2007,450:203-210.5 Reece EA, Ma XD