野生艾草黄酮的含量及抗氧化性研究

1、孙锋,张宽朝(安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036摘要目的:测定艾草中总黄酮含量,并对其抗氧化性、羟自由基(一OH的清除能力和过氧化值(POV进行了研究。方法:有机溶剂提取法从野生艾草中提取黄酮,以芦丁为对照品测定艾草中总黄酮含量。采用邻苯三酚自氧化测定抗氧化性;用新鲜猪油测定过氧化值(For。结果:艾草中总黄酮含量高达5.5%,对02一押制率为36.8%,黄酮浓度超过2mg/mL时对羟自由基(一OH清除能力逐渐增强,0.50%黄酮的POV较强,仅次于0.05%的维生素C,说明艾草黄酮有较好的开发价值。关键词艾草;黄酮;抗氧化性;羟自由基;过氧化值中图分类号:S567文献标识码:A文

2、章编号:10069690(2009030058一04Study on Total Content and Anti.oxidation Property ofFlavone in Agrestal Artemisia argyiSun Feng,Zhang Kuanchao(School of Life Science,Anhui Agriculture University,Hefei230036,ChinaAbstract Objective:To determine total flavone content in Artemisia argyi,study on antioxidati

3、onproperty,hydroxyl radical(一OHand peroxide value(POVof flavone.Methods:The total flavone was extracted from Artemisia argyi by organic solvent,and then the total content of flavone was determined Using mtin as contrast.Determining the antioxidationpropertywith Pyrogallolphthalein,the peroxide value

4、(POVwith flesh lard.Results:Total flavone content is5.5%inArtemisia argyi,antioxidation rate is36.8%,on the hydroxyl radical scavenging eapacit,is gradually high when the concentration of fla。vonoids is more than2mg/ml;POV of the0.5%flavone is stonger,second only to0.05%Vc.It shows that flavone in A

5、rtemisia argyi is good value for development.Key words Anemis/a argyi;flavone;antioxidation property;hydroxyl radical;peroxide value艾草(Artemisia argyi,又名香艾、艾蒿,为菊科蒿属多年生野生草本植物。艾草具有很高的药用价值2J,为我国传统中药,其主要化学成分有挥发油、桉叶烷、三萜类,黄酮类,还含有多种微量元素。近年来,对艾草在药学、化学成分】、药理作用、临床应用等方面的研究渐渐多起来。研究发现艾草具收稿日期:2008一08一13基金项目:安徽省教育

6、厅自然科学基金项目(1(J20078117作者简介:孙锋(1969一,男,安徽农业大学讲师,从事生物化学与天然产物开发研究张宽朝(1980一,男,安徽农业大学实验师。从事生物化学与天然产物开发实验工作。一58一有抗菌抗病毒、平喘镇咳4】、祛痰、抗过敏”1、镇静免疫、激励安神甚至有抗癌等之功效。黄酮类化合物,在食品和医药工业上有广泛的应用。具有降脂、抗血栓、抗氧化、降糖、抗肿瘤、增强免疫力、延缓衰老以及治疗慢性前列腺炎等多种生理活性作用】。本文以乙醇提取,以芦丁为对照品测定艾草中总黄酮含量,并对其并对其抗氧化性、羟自由基(一OH的清除能力和过氧化值(POV进行了研究,为艾草药用的进一步开发提供理

7、论依据。l材料与方法1.1材料第3期孙锋,等:野生艾草黄酮的含量及抗氧化性研究1.1。1原料艾草(野生、新鲜猪油。3mmol/L邻苯三酚溶液的配制:准确称取0.3783g邻苯三酚,用0.01mol/L HCI溶液溶解定容至100mL,再取10mL此溶液定容至100mL。UV722s可见分光光度计(上海民桥精密科学仪器有限公司;FAAll04电子分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司;DHG一9425A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司。1.2方法取艾草,60烘干,制成粉末。精密称取艾草粉末20g置于锥形瓶中,用200mL石油醚(60一9070圆流2次,3ll/次,除去脂及脂溶性色素。

8、滤渣60烘干,用200mL70%乙醇87回流两次,3h/次,合并滤液,即艾草的黄酮粗提液。取干燥恒重芦丁配成浓度为0.065mg/mL标准溶液,取上述标准溶液0.0,2.0,4.0,6.0,8.0, 10.0mL,分别置于25mL容量瓶中,加30%乙醇补足至12.5mL,加5%亚硝酸钠溶液0.7mL摇匀,放置5rain后,精确加入10%硝酸铝溶液0.7mL摇匀,放置5rain,精确加入l mol/L氢氧化钠溶液5mL,用30%乙醇稀释至刻度。以第1容量瓶为空白,于510nrll波长下测定吸光度,以吸光度为坐标,浓度为横坐标。绘制标准曲线,建立回归方程。o0.2高0.15答。?b5芦丁质量(mc

9、/m1.雷1芦丁标准曲线取提取液0.1mL,置于25mL容量瓶中,加30%乙醇补足至12.5mL,加5%亚硝酸钠溶液0.7mL摇匀,放置5min后,精确加人10%硝酸铝溶液0.7mL摇匀,放置5rain,精确加人1mol/L氢氧化钠溶液5mL,用30%乙醇稀释至刻度。以0.1 mL30%乙醇为空白,于510am波长下测定吸光度A,由标准曲线得对应浓度C,可算得艾草样品的总黄酮含量。1.2,2艾草黄酮对超氧阴离子自由基(02-的抑制盎取4.5mL50mmol/L TrisHCI缓冲溶液(pH8.2,4.2mL蒸馏水混匀后在25水浴中保温20rain,取出后立即加入在25预热过的3mmol/L邻苯

10、三酚0.3mL,迅速摇匀后倒人比色杯,420nm下每隔30s测定吸光度,计算线性范围内每分钟内吸光度的增加,以10mmol/L HCl溶液配制空白管作为对照。加入艾草黄酮后邻苯三酚自氧化速率的测定:按照上述步骤在加入邻苯三酚前先分别加入0.1mL的黄酮样品液,蒸馏水减少。同样以10mmol/L HCI溶液配制空白管作为对照。测定吸光度。抑制率(%=(AAl/出一A2/t/aal/缸100%式中:鲋。/血:邻苯三酚自氧化时反应速率;A,/缸:加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率在试管中依次移取l mmol/L硫酸亚铁2.5mL 和3mmol/L双氧水2.5mL,混合均匀后加人3mmol/L水杨酸

11、7.5IllL。在37。C的恒温水中反应15rain后在722S型分光光度计上在510nnl的波长下测其A值,该值即可作为如值。一59中国野生植物资源第28卷型分光光度计上在510nm的波长下测其A值,该值即可作为A。值。清除率(%=A/(AoA。X100%将黄酮的粗提液配制成0.05%,0.20%, 0.50%,1.00%的系列溶液,以0.05%维生素c作比较,移取某一浓度的系列溶液,各加入50mL新鲜猪油中,50水浴缓慢加热融化油样,并在升温过程中不时搅拌使成匀相,另取一瓶加同样猪油为空白。70恒温箱中强化保存,每隔12h搅拌1次,并交换在烘箱中的位置,以确保环境相同。每24h 定时测定P

12、OV值。每次取样后充分振摇,以混入足够的空气。按GB55381995测定POV值,进而比较不同浓度、不同抗氧化剂的抗氧化性。样品POV=(KKC1000/V空白POV=(%一KC1000/V式中:POV:过氧化值,meq/L;Vo:对照耗硫代硫酸钠的体积,mL;K:样品耗硫代硫酸钠的体积,mL;屹:空白耗硫代硫酸钠的体积,mL;C:硫代硫酸钠的浓度,mol/L;V:样品的体积,LU和屹的测定是精确量取1.5mL混匀样品,置于碘瓶中,加入三氯甲烷+冰乙酸溶液(体积比2 :315mL混匀,再加入0.1mol/L碘溶液(加入饱和碘化钾1.4g/mL做稳定剂1.5mL,摇匀,放在暗处5rain,然后加

13、水25mL,以2mmol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡黄色时,加入l%淀粉0.5mL 作为指示剂,继续滴定至蓝色消失为止。以空白试剂滴定为参比。2结果与分析2.I总黄酮含量的测定取0.1mL艾草的黄酮粗提液,按上述方法测的吸光度为0.11l3,代人回归方程,可算得艾草样品的总黄酮含量为:(0.11130.02713.5/ (O.357315100%=5.5%2.2艾草黄酮对超氧阴离子自由基(Of的抑制率表1邻苯三酚自氧化速率的测定黄酮抑制率(%=(0.0630.040/0.063100%=36.8%由表l结果可看出艾草黄酮对超氧阴离子自由基(Of有明显抑制作用。2.3艾草黄酮对羟自由基(一OH

14、的清除能力表2艾草黄酮对羟自由基的清除能力的A。值测定无艾草黄酮体系Ao值为0.4132鞠40一静一甏2扣甫彳手;育气币,图2艾草黄酮不同浓度对羟基自由基的清除能力由图2结果可知,艾草黄酮对羟自由基(一OH具有明显的清除作用,且随着质量分数的增加清除能增强。2.4艾草黄酮过氧化值(POV的测定表3各样品消耗的硫代硫酸钠的体积mL注:样品POV=(nv2cXl000/心空白POV=(%一%xCXl000/V一60一 野生艾草黄酮的含量及抗氧化性研究作者:孙锋, 张宽朝, Sun Feng, Zhang Kuanchao作者单位:安徽农业大学,生命科学学院,安徽,合肥,230036刊名:中国野生植

15、物资源英文刊名:CHINESE WILD PLANT RESOURCES年,卷(期:2009,28(3被引用次数:0次参考文献(11条1.浙江省平喘药研究协作组艾叶油新的平喘有效成分的研究 1982(062.李慧艾叶的药理研究进展及开发应用期刊论文-基层中药杂志 2002(033.Haruki Yamada.Katsumi Ohtani.Hiroaki Kiyohara Purification and chemical properties of anti-complementary polysccharide from the leaves of Artemisia princeps 19

16、85(024.浙江省平喘药研究协作组艾叶油新的平喘有效成分的研究 1982(0610.Imai Y.Tsukahara S.Asada S Phytoestrogens/flavonoids revers breast cancer resistanceprotein/ABCG2-medated multidrug resistence 2004(1211.Pedro M.Ferreira MM.Cidade H Artelatin is a cytotoxic prenylated flavone that disturbs microtubules and interferes with

17、DNA replication in MCF-7 human breast cancer 2005(33相似文献(1条1.学位论文姜慧萍黄酮类化合物体外抑制N-亚硝基二乙胺生成的研究2009NO2-在体内外的弱酸性条件下均可能与胺发生亚硝化反应生成强致癌性的N-亚硝胺,从而诱发机理癌变。因此,如何清除NO2-或抑制N-亚硝胺的生成,进而减少肿瘤的发病率已成为食品安全领域研究的热点之一。黄酮作为一种天然的植物次级代谢产物广泛分布于植物中,由于其具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等生理活性,已被开发成多种保健食品。随着对黄酮活性研究的不断深入,发现黄酮还具有清除NO2-、抑制N-亚硝胺生成的功效,目前这方

18、面的研究仍停留在黄酮粗提物的水平上,如竹叶黄酮、甘草黄酮、苦荞黄酮等。本研究对黄酮单体抑制N-亚硝基二乙胺(N-nitrosodiethylamine,NDEA的合成进行了深入的探索,为有效利用黄酮类化合物作为外源性的N-亚硝胺合成抑制剂奠定基础。研究内容包括:1.建立NO2-和NDEA的测定方法。2.以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCE作为参比,选择槲皮素、木犀草素、白杨素三种不同结构的单体黄酮为研究对象,考察黄酮结构、浓度、抗氧化力与NDEA生成量之间的关系。选择邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、邻苯三酚为对象,探讨酚羟基位置及数量对NDEA生成的影响。3.在模拟胃液条件下(pH3.0,37,

19、分析黄酮的代表性物质槲皮素抑制NDEA生成后所得的产物。利用制备型高效液相(PRE-HPLC对产物进行分离纯化;用紫外可见光分光光度计(UV/VIS、高效液相-质谱联用仪(HPLC-MS/MS及核磁共振氢谱(1H-NMR鉴定产物结构;利用混合物的1H-NMR特征图谱推测产物的含量关系,利用反相高效液相色谱-二极管阵列检测器(RP-HPLC-DAD验证所推测的结果。4.在此基础上,对菊米、银杏叶、艾草3种植物的黄酮粗提物进行研究,考察了NO2-清除率及NDEA生成的抑制率随粗提物浓度、反应时间、pH、温度的变化。研究结果如下:1.槲皮素、木犀草素、白杨素均具有清除NO2-的能力,清除率随黄酮浓度的增加而增加,大小依次为:槲皮素木犀草素白杨素。三种黄酮对致癌物NDEA的生成具有双重影响-低浓度下起促进作用,高浓度下起抑制作用。清除率及抑制率和黄酮的抗氧化能力成正比。通过比较具有不同酚羟基结构的苯酚类化合物对NDEA生成的影响推测黄酮类化合物的双重作用效果与黄酮摩尔浓度及其酚羟基位置有关:黄酮类化合物各环上的酚羟基活性相差较大,B环酚羟基活性最高,C环酚羟基次之,A环酚羟基活性最弱。当黄酮浓度达到一定量后,NO2-完全被黄酮B环上的邻位酚羟基反应生成了稳定的邻苯醌型产物,从