蛋白质组学及其在微生物学研究中的应用

1、精选ppt1 第第1111章章 蛋白质组学及其在微生物学蛋白质组学及其在微生物学 研究中的应用研究中的应用精选ppt2 第一节第一节 引言引言 第二节第二节 蛋白质组学研究基本技术蛋白质组学研究基本技术 第三节第三节 微生物蛋白质组学微生物蛋白质组学主要内容主要内容精选ppt3 第一节第一节 引言引言背背 景景基因组时代基因组时代 后基因组时代后基因组时代 核苷酸序列本身很难直接与生命功能和生命核苷酸序列本身很难直接与生命功能和生命现象挂起钩，而蛋白质才是生物功能的最终现象挂起钩，而蛋白质才是生物功能的最终执行者。执行者。蛋白质数目大大超过基因数目。蛋白质数目大大超过基因数目。 蛋白质随时蛋白

2、质随时间和空间而变化。间和空间而变化。 精选ppt4mRNAmRNA水平的基因表达研究取得进水平的基因表达研究取得进 展，但展，但mRNAmRNA与蛋白质间的相关系与蛋白质间的相关系数仅为数仅为0.5 蛋白质自身特点难以从蛋白质自身特点难以从DNADNA和和mRNAmRNA水平得到解答水平得到解答 精选ppt5蛋白质组学的概念蛋白质组学的概念n蛋白质组是澳大利亚学者蛋白质组是澳大利亚学者WilliamsWilliams和和WilkinsWilkins于于19941994年首先提出，年首先提出，n被定义为：被定义为：一个基因组一个基因组/ /一种生物或一种生物或一种细胞一种细胞

3、/ /组织所表达的全部蛋白质。组织所表达的全部蛋白质。 精选ppt6n对应于基因组的所有蛋白质构成的对应于基因组的所有蛋白质构成的整整体体，不是局限于一个或几个蛋白质。，不是局限于一个或几个蛋白质。 n同一基因组在不同细胞、不同组织中同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同的表达情况各不相同 。n在空间和时间上在空间和时间上动态变化动态变化着的整体着的整体。蛋白质组是：蛋白质组是：精选ppt7蛋白质组学蛋白质组学(proteomics)(proteomics) 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，兴科学，其目的其目的是从整体的角度分

4、析细胞内动是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。蛋白质功能与细胞生命活动规律。 精选ppt8 蛋白质组学研究的内容蛋白质组学研究的内容1 1、蛋白质表达模式、蛋白质表达模式( (或蛋白质组组成或蛋白质组组成) )的研究的研究 蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中的蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中的与基因组学相对应的主要内容。它要求对蛋白质组与基因组学相对应的主要内容。它要求对蛋白质组进行表征进行表征, ,即实现所有

5、蛋白质的分离、鉴定及其图谱即实现所有蛋白质的分离、鉴定及其图谱化。化。双向凝胶电泳双向凝胶电泳(2-D(2-D) )和质谱和质谱( (Mass spectrometry) )技术是当前分离鉴定蛋白质的两大支技术是当前分离鉴定蛋白质的两大支柱技术柱技术 2 2、蛋白质组功能模式、蛋白质组功能模式( (目前主要集中在蛋白目前主要集中在蛋白质相互作用网络关系质相互作用网络关系) )的研究的研究精选ppt9大规模的蛋白质分析过程大规模的蛋白质分析过程n样品制备样品制备n是蛋白质组研究的第一步也是最关键的一步。是蛋白质组研究的第一步也是最关键的一步。n蛋白质分离（技术）：蛋白质分离（技术）：n二维电泳（

6、核心技术）、多维色谱二维电泳（核心技术）、多维色谱n蛋白质分析与鉴定（技术）：蛋白质分析与鉴定（技术）：n质谱技术（核心技术）、蛋白质芯片技术、酵母双杂质谱技术（核心技术）、蛋白质芯片技术、酵母双杂交技术和噬菌体表面展示技术等。交技术和噬菌体表面展示技术等。 蛋白质组发展的蛋白质组发展的瓶颈瓶颈是缺乏自动化的蛋白质分析是缺乏自动化的蛋白质分析的完整途径。的完整途径。精选ppt10第二节第二节 蛋白质组学研究基本技术蛋白质组学研究基本技术n典型的蛋白质组学研究常分为四个步骤：型的蛋白质组学研究常分为四个步骤：从生物学物质（如细胞、组织、体液等）从生物学物质（如细胞、组织、体液等）提取蛋白质混合液

7、提取蛋白质混合液分离蛋白质混合液分离蛋白质混合液将有意义的蛋白质消化将有意义的蛋白质消化成肽进行质谱分析成肽进行质谱分析将质谱获得的数据利用各种将质谱获得的数据利用各种生物信息学工具进行分析生物信息学工具进行分析精选ppt11n蛋白质组学发展依赖于高通量分离、鉴蛋白质组学发展依赖于高通量分离、鉴定和解析蛋白质技术的进步。定和解析蛋白质技术的进步。n重要技术突破主要包括三点：重要技术突破主要包括三点：n固相化固相化pH梯度二维电泳（梯度二维电泳（IPG-2-DE)的的发明与完善；发明与完善；n生物质谱生物质谱，即应用软电离技术对生物大分，即应用软电离技术对生物大分子进行分析的质谱技术的发展；子进

8、行分析的质谱技术的发展；n生物信息学生物信息学发展。发展。精选ppt12一、蛋白质组研究中的蛋白质分离（一）、二维（双向）凝胶电泳（一）、二维（双向）凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE)： 利用蛋白质的利用蛋白质的等电点和分子量等电点和分子量，结合凝胶，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。化学特性，分离各种蛋白质的方法。精选ppt13原原 理理 第一向第一向在高压电场下对蛋白质进行等电在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦电泳技术聚焦电泳技术(IEF)(IEF)将蛋白质混合物按照将蛋白质混合物按照等电点高低等电点高低进行分离进行分离, , 再在第一

9、向再在第一向垂直垂直方向方向上进行上进行第二向第二向SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)按照相对分子质量大小按照相对分子质量大小进行蛋白质分离。进行蛋白质分离。 精选ppt14特特 点点n可分离可分离10100 kD分子量的蛋白质分子量的蛋白质 n高灵敏度和高分辨率高灵敏度和高分辨率n便于计算机进行图像分析处理便于计算机进行图像分析处理 n与质谱分析匹配与质谱分析匹配 精选ppt15n在在IEFIEF的电泳中，具有的电泳中，具有pHpH梯度的介质其分布是从梯度的介质其分布是从阳极阳极到到阴极阴极，pHpH值逐渐增大。而蛋白质分子具有值逐渐

10、增大。而蛋白质分子具有两性解离两性解离及及等电点等电点的特征，这样在的特征，这样在碱性碱性区域蛋白区域蛋白质分子带质分子带负负电荷向阳极移动，直至某一电荷向阳极移动，直至某一pHpH位点时位点时失去电荷而停止移动，此处介质的失去电荷而停止移动，此处介质的pHpH恰好等于聚恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（焦蛋白质分子的等电点（pIpI）。同理，位于）。同理，位于酸性酸性区域的蛋白质分子带区域的蛋白质分子带正正电荷向阴极移动，直到它电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质点是蛋白质组分组分的特性的特性量度量度，将等电点不同

11、的蛋，将等电点不同的蛋白质混合物加入有白质混合物加入有pHpH梯度的凝胶介质中，在梯度的凝胶介质中，在电场电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的电点相应的pHpH位置上，形成分离的蛋白质区带。位置上，形成分离的蛋白质区带。 第一向第一向IEF电泳电泳原原 理理精选ppt16 n传统传统OFarrell系统双向电泳的缺陷。系统双向电泳的缺陷。npH凝胶制作的不稳定和重复性差限制了凝胶制作的不稳定和重复性差限制了等点聚焦电泳技术的应用，等点聚焦电泳技术的应用，nBjellgvist等发展并完善了固相等发展并完善了固相pH梯梯度等电聚焦技术

12、，度等电聚焦技术，Grg等成功地将之等成功地将之应用于双向电泳应用于双向电泳。 优点优点 精选ppt17固相固相pHpH梯度等电聚焦的优点梯度等电聚焦的优点克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。稳定的可以随意精确设定的稳定的可以随意精确设定的pH梯度。梯度。 尤其可在较窄的尤其可在较窄的pH范围内进行第二范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。轮分析，大大提高了分辨率及重复性。精选ppt18第二向第二向SDS-PAGE电泳电泳 垂直板电泳垂直板电泳 水平超薄胶电泳水平超薄胶电泳 精选ppt19双向电泳典型过程包括：双向电泳典型过程包括：n蛋白质样品制备：

13、蛋白质样品制备：要防止蛋白质酶降解蛋白质。要防止蛋白质酶降解蛋白质。n上样上样n一种是一种是IPGIPG胶条重泡胀衙利用加样杯边运行等点聚焦边上胶条重泡胀衙利用加样杯边运行等点聚焦边上样。样。n别一种是将样品与重泡胀液混合，在别一种是将样品与重泡胀液混合，在IPGIPG胶条泡胀的同时胶条泡胀的同时样品出参入了胶条。样品出参入了胶条。nIPGIPG的运行和平衡的运行和平衡nSDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳n胶上蛋白质检测和定量：胶上蛋白质检测和定量：n荧光染色灵敏度比考染高而与银染相仿，线性范围要远荧光染色灵敏度比考染高而与银染相仿，线性范围要远高地银染，与质谱兼容性好。高地银染

14、，与质谱兼容性好。n图像采集、分析及数据处理图像采集、分析及数据处理精选ppt20精选ppt212-DE技术的缺点技术的缺点 所能分离的蛋白质的性质有一定限制，如蛋白质分所能分离的蛋白质的性质有一定限制，如蛋白质分离范围一般为离范围一般为8200kD，对极碱性蛋白质，疏水性蛋，对极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，包含信号蛋白和转录因子的低丰度蛋白质难于白质，包含信号蛋白和转录因子的低丰度蛋白质难于有效分离。有效分离。 在在2D胶上有些蛋白质点量太少，难以进胶上有些蛋白质点量太少，难以进行质谱鉴定；操作费时、费力，自动化程度低行质谱鉴定；操作费时、费力，自动化程度低难于与质谱联用实现自动化性质联用。难

15、于与质谱联用实现自动化性质联用。 精选ppt222、新型非凝胶技术、新型非凝胶技术 高效液相色谱法高效液相色谱法High performance liquid chromatography，HPLC毛细管电泳毛细管电泳capillary electrophoresis，CE液相等点聚焦和毛细管色谱液相等点聚焦和毛细管色谱capillary electrochromatography 特点：特点： 自动化程度高、分辨率高，检测限低。自动化程度高、分辨率高，检测限低。精选ppt23采用凝胶技术和非凝胶技术进行蛋白质组学研究采用凝胶技术和非凝胶技术进行蛋白质组学研究的基本路线的基本路线精选ppt24

16、n在非凝胶分离技术中，高效液相色谱由于其分离在非凝胶分离技术中，高效液相色谱由于其分离原理多样，易于组合多维分离模式和与质谱直接原理多样，易于组合多维分离模式和与质谱直接联用而获得了广泛的研究和应用。联用而获得了广泛的研究和应用。n高效液相色谱的原理：高效液相色谱的原理：溶于流动相中各组分经过溶于流动相中各组分经过固定相时，与固定相发生相互作用，由于相互作固定相时，与固定相发生相互作用，由于相互作用大小、强弱的不同，各组分在固定相中滞留的用大小、强弱的不同，各组分在固定相中滞留的时间不同，由此从固定相中流出的先后也不同，时间不同，由此从固定相中流出的先后也不同，最终使不同组成成分得到分离。最终

17、使不同组成成分得到分离。n经典的高效液相色谱系统经典的高效液相色谱系统由输液系统、进样系统、由输液系统、进样系统、分离系统和检测系统构成。质谱起到了检测器的分离系统和检测系统构成。质谱起到了检测器的作用。作用。精选ppt25n液质联用技术液质联用技术（LC-MS/MSLC-MS/MS） 蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替代替2-DE的分离，然后进入的分离，然后进入MS系统获得肽系统获得肽段分子量，再通过串联段分子量，再通过串联MS技术，得到部分技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。蛋白质。 精选p

18、pt26 根据蛋白质带电性及疏水性不同，根据蛋白质带电性及疏水性不同，用用MS分离多肽复合物。分离多肽复合物。 n多维多维色谱技术（色谱技术（LC/LC-MS/MS） n多维蛋白质鉴定技术多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein identification technology) 从从色谱柱中流出有多肽直接进入质谱分析进色谱柱中流出有多肽直接进入质谱分析进行蛋白质鉴定。行蛋白质鉴定。 精选ppt27二、生物质谱与蛋白质鉴定二、生物质谱与蛋白质鉴定（一）、基本原理（一）、基本原理n质谱技术的质谱技术的基本原理基本原理：样品分子离子化后，：样品分子离子化后，根据离子间

19、质荷比（根据离子间质荷比（m/zm/z）的差异来分离并）的差异来分离并确定样品的分子量。确定样品的分子量。 n 一个完整的质谱分析仪由一个完整的质谱分析仪由进样系统、进样系统、离子离子化源、质量分析器、化源、质量分析器、离子检测器和数据分离子检测器和数据分析系统析系统5 5个部分组成个部分组成精选ppt28 四极杆质谱（四极杆质谱（quadrupole,Qquadrupole,Q）、）、 离子阱质谱（离子阱质谱（ion trap,ITion trap,IT）n飞行时间质谱飞行时间质谱（ time of flight time of flight ，TOF TOF ） n傅里叶变换离子回旋共振质

20、谱（傅里叶变换离子回旋共振质谱（fourier fourier transform cyclotron resonance, FTICRtransform cyclotron resonance, FTICR） 常用的质谱分析技术常用的质谱分析技术精选ppt29n电喷雾离子化（电喷雾离子化（electrospray ionization ， ESI） 和基质辅助激光解吸电离（和基质辅助激光解吸电离（matrix-assisted laser desorption ionization ，MALDI）等）等软电软电离技术离技术的发明和成熟才使质谱技术真正应用到生物的发明和成熟才使质谱技术真正应用

21、到生物大分子分析领域，使得在大分子分析领域，使得在fmol(10-15)乃至乃至attomole(10-18)水平检测相对分子质量高达几十水平检测相对分子质量高达几十万的生物大分子成为可能。这也使得有机质谱发展万的生物大分子成为可能。这也使得有机质谱发展成为了一个崭新的领域成为了一个崭新的领域生物质谱。生物质谱。精选ppt30n电喷雾离子化：电喷雾离子化：是利用喷口的高电场使质谱是利用喷口的高电场使质谱仪进样端毛细管柱流出的含有样品的液体成仪进样端毛细管柱流出的含有样品的液体成为带电荷的微滴。随着挥发性溶剂的蒸发，为带电荷的微滴。随着挥发性溶剂的蒸发，微滴半径减少而表面电荷密度增加，直至达微滴

22、半径减少而表面电荷密度增加，直至达到一定临界值，液滴爆裂为带电荷的子微滴。到一定临界值，液滴爆裂为带电荷的子微滴。这一过程不断重复使最终的微滴非常细小呈这一过程不断重复使最终的微滴非常细小呈雾状。这时液滴表面的电场很强，使蛋白质雾状。这时液滴表面的电场很强，使蛋白质等被分析分子离子化并以带一个或多个电荷等被分析分子离子化并以带一个或多个电荷的离子的形式进入气相。的离子的形式进入气相。精选ppt31n基质辅助激光解吸电离：基质辅助激光解吸电离：是将样品均匀包是将样品均匀包埋在固体基质并形成晶体，当用埋在固体基质并形成晶体，当用337nm337nm的氮的氮激光照射晶体时，基质吸收激光提供的能激光照

23、射晶体时，基质吸收激光提供的能量而汽化，样品分子解吸附，基质样品量而汽化，样品分子解吸附，基质样品间发生电荷转移使样品分子电离。间发生电荷转移使样品分子电离。精选ppt32“软电离软电离”的特点的特点n分子电离时保留整个分子的完整性，分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。不会形成碎片离子。 n灵敏度高、快速、能同时提供样品的灵敏度高、快速、能同时提供样品的精确分子量和结构信息、既可定性又精确分子量和结构信息、既可定性又可定量、并能有效地与各种色谱联用可定量、并能有效地与各种色谱联用来分析复杂体系。来分析复杂体系。 精选ppt33 在蛋白质组学研究中，为了提高质谱的适用范围在蛋白质组

24、学研究中，为了提高质谱的适用范围和工作性能，常将不同类型的质量分析器串联起和工作性能，常将不同类型的质量分析器串联起来使用。因此，目前最为常用的质谱分析系统包来使用。因此，目前最为常用的质谱分析系统包括两大类：括两大类： 以单一质谱为基础的以单一质谱为基础的 电喷雾三级四级杆质谱电喷雾三级四级杆质谱 电喷雾离子阱质谱电喷雾离子阱质谱 电喷雾傅里叶变换离子回旋共振质谱电喷雾傅里叶变换离子回旋共振质谱 基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱 以串联质谱为基础的以串联质谱为基础的 电喷雾三级四级杆飞行时间质谱电喷雾三级四级杆飞行时间质谱 基质辅助激光解吸离子化三级四级杆

25、飞行时间质谱基质辅助激光解吸离子化三级四级杆飞行时间质谱 基质辅助激光解吸离子化串联飞行时间质谱基质辅助激光解吸离子化串联飞行时间质谱精选ppt34（二）、应用生物质谱鉴定蛋白质（二）、应用生物质谱鉴定蛋白质 肽质量指纹谱（肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting，PMF）是蛋白质的一种重要属性，也是目前蛋白质组）是蛋白质的一种重要属性，也是目前蛋白质组学研究中鉴定蛋白质的常用研究方法之一。学研究中鉴定蛋白质的常用研究方法之一。1993年年由多研究小组分别独立提出。由多研究小组分别独立提出。 肽质量指纹谱肽质量指纹谱指的是蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶指的是蛋白质被酶

26、切位点专一的蛋白酶切割后得到的一套特征性有肽片断质量图谱。由于每切割后得到的一套特征性有肽片断质量图谱。由于每种蛋白质的氨基酸序列都不相同，蛋白质被特异性的种蛋白质的氨基酸序列都不相同，蛋白质被特异性的蛋白酶消化后所产生的肽片断序列及其质量的构成也蛋白酶消化后所产生的肽片断序列及其质量的构成也具有特异性，可用于与数据库中所有蛋白质酶解的理具有特异性，可用于与数据库中所有蛋白质酶解的理论肽质量谱匹配来鉴定蛋白质。论肽质量谱匹配来鉴定蛋白质。 目前测定肽混合物质量谱目前测定肽混合物质量谱最有效的质谱仪最有效的质谱仪是基质辅助是基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱（激光解吸离子化飞行时间质谱（MALD

27、I-TOF-MS)，适合测定的相对分子质量范围在五百到数千道尔顿，适合测定的相对分子质量范围在五百到数千道尔顿，并需要用已知相对分子质量的蛋白质作内标。并需要用已知相对分子质量的蛋白质作内标。精选ppt35鉴定和注释蛋白质的路线鉴定和注释蛋白质的路线 n通过肽质量谱指纹图（通过肽质量谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹）和数据库搜寻匹配配 n通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配 精选ppt36精选ppt37 仪仪 器器 nMALDI-TOFMS质谱

28、仪：灵敏度高（可达质谱仪：灵敏度高（可达fmol），分析速度快，谱图简单易于解析以），分析速度快，谱图简单易于解析以及受缓冲液、盐份的干扰小及受缓冲液、盐份的干扰小 .n缺点：缺点：只能鉴定数据库中已经存在的蛋白质，只能鉴定数据库中已经存在的蛋白质，而且有一部分蛋白质在只有而且有一部分蛋白质在只有PMF信息时不能信息时不能得到可靠的鉴定，因此需要进一步分析肽段的得到可靠的鉴定，因此需要进一步分析肽段的序列信息来鉴定蛋白质序列信息来鉴定蛋白质精选ppt38n串联质谱的肽序列标签（串联质谱的肽序列标签（PST）n应用串联质谱中得到的部分氨基酸序列结应用串联质谱中得到的部分氨基酸序列结合此序列前后的

29、离子质量和肽段母离子质合此序列前后的离子质量和肽段母离子质量，在数据库中检索以鉴定蛋白质，称为量，在数据库中检索以鉴定蛋白质，称为肽序列标签技术。肽序列标签技术。n相比单独的肽质量指纹谱技术，相比单独的肽质量指纹谱技术，PST搜索搜索数据库得到的结果更可信。数据库得到的结果更可信。n一般串联质谱仪电喷雾串联质谱（一般串联质谱仪电喷雾串联质谱（ESI-MS/MS)可用于肽段序列的测定。可用于肽段序列的测定。精选ppt39组织切片或印片原位质谱分析技术组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）傅里叶转换回旋共振质谱（傅里叶转换回旋共振质

30、谱（FTMS） 表面增强激光解吸表面增强激光解吸/电离飞行时间质电离飞行时间质谱（谱（SELDI-TOF-MS） 联合技术精确鉴定蛋白质联合技术精确鉴定蛋白质 精选ppt40 概念：概念：把一个基因组表达的全部把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂体系中所有的蛋白质或一个复杂体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。蛋白质进行精确的定量和鉴定。 （三）、定量蛋白质组学研究（三）、定量蛋白质组学研究精选ppt41 低丰度蛋白质检测困难低丰度蛋白质检测困难 蛋白质表达量差异很小，如在蛋白质表达量差异很小，如在50%以以下时，精确定量成为瓶颈下时，精确定量成为瓶颈 蛋白质表达的瞬时变化蛋白质表达的瞬时

31、变化 蛋白质定量的难点蛋白质定量的难点精选ppt42目前常用的蛋白质组定量方法包括：目前常用的蛋白质组定量方法包括：n1、基于荧光染色技术的电泳定量法、基于荧光染色技术的电泳定量法n2、基于稳定同位素技术的质谱定量法、基于稳定同位素技术的质谱定量法精选ppt431 1基于荧光染色技术的电泳基于荧光染色技术的电泳定量法定量法 双向凝胶电泳双向凝胶电泳(2-DE)是目前唯一能分离展是目前唯一能分离展示大量蛋白质并进行蛋白质定量分析的一种示大量蛋白质并进行蛋白质定量分析的一种方法。方法。 荧光差异显示双向电泳（荧光差异显示双向电泳（F-2D-DIGE） 精选ppt44n用于蛋白质检测的荧光染料有两大

32、类：用于蛋白质检测的荧光染料有两大类：n一类能与蛋白质共价结合的荧光染料，如花菁一类能与蛋白质共价结合的荧光染料，如花菁染料染料Cy3,Cy5.n另一类是非共价结合荧光染料，包括苯乙烯基另一类是非共价结合荧光染料，包括苯乙烯基染料染料 Sypro系列、尼罗河红等。系列、尼罗河红等。n荧光染色常用的方式有两种：荧光染色常用的方式有两种：n二维电泳前进标记二维电泳前进标记n电泳后标记电泳后标记http:/ 同位素标记法基本同位素标记法基本原理：原理：将待比较的一对肽段样将待比较的一对肽段样品中的一个进行同位素标记，另一个不标记，标记品中的一个进行同位素标记，另一个不标记，标记和未标记的同一肽段，其

33、色谱行为一致的，进而可和未标记的同一肽段，其色谱行为一致的，进而可以利用它们的质量差异确定在质谱仪中的信号对，以利用它们的质量差异确定在质谱仪中的信号对，通过比较信号对之间相对强弱就可以准确地计算标通过比较信号对之间相对强弱就可以准确地计算标记和未标记肽段的相对丰度。记和未标记肽段的相对丰度。 同位素标记方法有：同位素标记方法有： 体内标记（代谢标记）体内标记（代谢标记） 体外标记：根据标记部位又可分为：巯基（体外标记：根据标记部位又可分为：巯基（SHSH）标记、）标记、氨基标记和羧基标记氨基标记和羧基标记精选ppt46精选ppt47三、三、 微生物蛋白质组学微生物蛋白质组学（一）病毒微生物蛋

34、白质组学（一）病毒微生物蛋白质组学n由于病毒微生物与感染性疾病密切相关，研究这由于病毒微生物与感染性疾病密切相关，研究这些致病微生物的蛋白质组学对于了解其毒性因子、些致病微生物的蛋白质组学对于了解其毒性因子、抗原以及疫苗的制备非常重要。抗原以及疫苗的制备非常重要。n在已完成基因组测序的在已完成基因组测序的47种致病苏白及其菌株种致病苏白及其菌株中，有中，有14种已进行过蛋白质组研究，其中对大种已进行过蛋白质组研究，其中对大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、结合分支杆菌等三种肠埃希菌、流感嗜血杆菌、结合分支杆菌等三种菌还进行过模式菌和临床致病菌的差异蛋白质组菌还进行过模式菌和临床致病菌的差异蛋白质组比较研

35、究。比较研究。精选ppt48n病原微生物蛋白质组研究主要有以下几病原微生物蛋白质组研究主要有以下几方面：方面：（1）遗传与变异方面的研究）遗传与变异方面的研究n主要是通蛋白质研究结果与基因组预测的主要是通蛋白质研究结果与基因组预测的（开放阅读框）（开放阅读框）ORFORF相比较来较正基因组的相比较来较正基因组的研究结果。蛋白质组的研究结果可以对基因研究结果。蛋白质组的研究结果可以对基因组的研究结果起到补充和修正的作用，而且组的研究结果起到补充和修正的作用，而且通过同一致病菌不同菌株的蛋白质研究，可通过同一致病菌不同菌株的蛋白质研究，可以对病株进行分类。以对病株进行分类。精选ppt49（2）病原

36、菌致病机理及毒力因子的研究）病原菌致病机理及毒力因子的研究n通过在整体水平上比较病原菌和非致病菌的蛋白质谱，通过在整体水平上比较病原菌和非致病菌的蛋白质谱，以及在各种环境下致病菌毒力和蛋白质谱的变化，可以及在各种环境下致病菌毒力和蛋白质谱的变化，可以发现致病株的毒力调控机制和毒力因子。以发现致病株的毒力调控机制和毒力因子。（3）研究宿主和微生物的相互关系，寻找免疫靶）研究宿主和微生物的相互关系，寻找免疫靶点，开发新型疫苗点，开发新型疫苗n蛋白质组研究方法与免疫杂交方法相结合的研究已广蛋白质组研究方法与免疫杂交方法相结合的研究已广泛应用于宿主对病原菌的体液和细胞免疫应答研究中，泛应用于宿主对病原

37、菌的体液和细胞免疫应答研究中，并形成了蛋白质的一个新的分支并形成了蛋白质的一个新的分支免疫蛋白质组。免疫蛋白质组。通过细菌蛋白质组与宿主多克隆血清的杂交反应，可通过细菌蛋白质组与宿主多克隆血清的杂交反应，可以发现新的抗原决定因子群，以用于疫苗开发和诊断以发现新的抗原决定因子群，以用于疫苗开发和诊断分析。分析。精选ppt50（4）药物抗性的研究）药物抗性的研究n通过抗性菌株与敏感菌株的差异蛋白质组研究，通过抗性菌株与敏感菌株的差异蛋白质组研究，可以对细菌耐药机制进行研究，发现抗药性相关可以对细菌耐药机制进行研究，发现抗药性相关因子，为新药研究提供线索。因子，为新药研究提供线索。（5）抗菌药物的开发）抗菌药物的开发n首先是通过分析细菌对抗菌药物有不同的反应的首先是通过分析细菌对抗菌药物有不同的反应的菌株的蛋白质组可以寻找新的抗菌药物筛选靶点菌株的蛋白质组可以寻找新的抗菌药物筛选靶点和模式。而利用一组作用位点类似的抗菌药物可和模式。而利用一