免疫标记技术ppt课件

1、第一节第一节 免疫标志技术简介免疫标志技术简介 将某种可微量或超微量测定的物质如将某种可微量或超微量测定的物质如放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等标志于抗原抗体上制成标志物，参与到标志于抗原抗体上制成标志物，参与到抗原抗体的反响体系中与相应的抗体抗原抗原抗体的反响体系中与相应的抗体抗原反响，以检测标志物的有无及含量的多少，反响，以检测标志物的有无及含量的多少，间接反映被测物的存在。称做免疫标志技术间接反映被测物的存在。称做免疫标志技术immunolabelling techniqueimmunolabelling technique。 免疫标志技术概念免疫

2、标志技术概念优点优点: :特异、敏感、快速；能定性特异、敏感、快速；能定性和定量甚至定位，且易于察看。和定量甚至定位，且易于察看。 免疫标志技术的分类免疫标志技术的分类免疫荧光标志技术免疫荧光标志技术免疫酶标志技术免疫酶标志技术放射免疫测定法放射免疫测定法 金免疫技术、化学发光免疫技术、免疫印迹技术、流式细胞术 一、免疫荧光标志技术一、免疫荧光标志技术 (immunofluorescence,IF) (immunofluorescence,IF) 用荧光素与抗体衔接成荧光抗用荧光素与抗体衔接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反响，荧体，再与待检标本中抗原反响，荧光显微镜下察看，抗原光显微镜下察看，

3、抗原- -抗体复合物抗体复合物分发荧光，借此对抗原进展定性或分发荧光，借此对抗原进展定性或定位。定位。 免疫荧光法可用于检测多种病免疫荧光法可用于检测多种病原体的抗原、抗体，或鉴定免疫细原体的抗原、抗体，或鉴定免疫细胞膜抗原。胞膜抗原。 二、免疫酶标志技术二、免疫酶标志技术 (enzyme immunoassay,EIA) (enzyme immunoassay,EIA) 将抗原将抗原- -抗体反响的特异性与酶催抗体反响的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反响断定结果。运用酶于底物的显色反响断定结果。运用酶标测定仪测定光密度标测定仪测定光密

4、度ODOD值可反映值可反映抗原含量，灵敏度达抗原含量，灵敏度达ng/mlng/ml甚至甚至pg/mlpg/ml程度。程度。 三、放射免疫测定法三、放射免疫测定法 (radioimmunoassay,RIA) (radioimmunoassay,RIA) 用放射性核素标志抗原或抗体进展免用放射性核素标志抗原或抗体进展免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原敏度和抗原- -抗体反响的特异性，检测灵抗体反响的特异性，检测灵敏度达敏度达pgpg程度。程度。 常用于标志的放射性核素为常用于标志的放射性核素为125I125I和和131I131I，分为液相和固相两种方

5、法。，分为液相和固相两种方法。 常用于测定微量物质，如胰岛素、生常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素；吗啡、长激素、甲状腺素、孕酮等激素；吗啡、地高辛、地高辛、IgEIgE等。等。一、荧光根底知识简介一、荧光根底知识简介一荧光的产生一荧光的产生 一些化学物质能从外界吸收并储存一些化学物质能从外界吸收并储存能量如光能、化学能等而进入激能量如光能、化学能等而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的方式放射过剩的能量可以电磁辐射的方式放射即发光。即发光。第二节 免疫荧光标志技术荧光免疫技术普通运用致荧光物质进荧光免疫技

6、术普通运用致荧光物质进展标志。展标志。荧光种类荧光种类致荧光：光激发产生致荧光：光激发产生化学荧光化学荧光X X线荧光线荧光阴极射线荧光阴极射线荧光 可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停顿可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停顿供能，发光荧光景象也随之在瞬间内消逝。供能，发光荧光景象也随之在瞬间内消逝。荧光发射的特点是：荧光发射的特点是：二荧光效率二荧光效率 荧光效率是指荧光分子将吸收的光荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。光量子的数值成正比。 荧光效率发射荧光的光量子数荧光效率

7、发射荧光的光量子数/ / 吸收光的光量子数吸收光的光量子数三荧光的猝灭三荧光的猝灭 荧光分子的辐射才干在遭到激发光较长荧光分子的辐射才干在遭到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的方式发射收的能量无法以荧光的方式发射 荧光物质的保管应留意防止光特荧光物质的保管应留意防止光特别是紫外光的直接照射和与其他化合别是紫外光的直接照射和与其他化合物的接触。物的接触。 四常用的免疫标志荧光物质四常用的免疫标志荧光物质 1 1、异硫氰酸荧光素、异硫氰酸荧光素fluoresc

8、einisothiocyanate,FITCfluoresceinisothiocyanate,FITC 黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。精等溶剂。 最大吸收光波长为最大吸收光波长为490nm490nm495nm495nm，最大，最大发射光波长发射光波长520nm520nm530nm530nm，呈现亮堂的黄，呈现亮堂的黄绿色荧光，在冷暗枯燥处可保管多年，是绿色荧光，在冷暗枯燥处可保管多年，是运用最广泛的荧光素。运用最广泛的荧光素。 其主要优点是：其主要优点是： 人眼对黄绿色较为敏感，人眼对黄绿色较为敏感， 通常切片标本中的绿色荧光通常切片标本中的绿

9、色荧光 少于红色。少于红色。2 2、四乙基罗丹明、四乙基罗丹明 rhodamine,RIB200rhodamine,RIB200 橘红色粉末，易溶于酒精。性质稳橘红色粉末，易溶于酒精。性质稳定，可长期保管。定，可长期保管。 最大吸收光波长为最大吸收光波长为570nm570nm，最大发射，最大发射光波长为光波长为595nm595nm600nm600nm，呈橘红色荧光。，呈橘红色荧光。3 3、四甲基异硫氰酸罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明tetramethylrhodamineisothiocyanate,tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITCTRITC 紫红

10、色结晶粉末，溶于水和酒精。最紫红色结晶粉末，溶于水和酒精。最大吸引光波长为大吸引光波长为550nm550nm，最大发射光波长，最大发射光波长为为620nm620nm，呈橙红色荧光。，呈橙红色荧光。 与与FITCFITC的翠绿色荧光对比鲜明，可的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标志或对比染色，其异硫配合用于双重标志或对比染色，其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。二、荧光免疫标志技术原理和方二、荧光免疫标志技术原理和方法法一原一原 理理 荧光免疫技术是用化学方法使荧光荧光免疫技术是用化学方法使荧光素标志的抗体或抗原与组织或细素标志的抗体或抗原与组织或细胞

11、中的相应抗原或抗体结合，进胞中的相应抗原或抗体结合，进展定性定位检查抗原或抗体的方法。展定性定位检查抗原或抗体的方法。二方二方 法法 1 1、直接荧光法、直接荧光法 把荧光抗体加到待检的细胞悬液、细把荧光抗体加到待检的细胞悬液、细胞涂片或组织切片上进展染色，经抗原胞涂片或组织切片上进展染色，经抗原抗体反响后，洗去未结合的荧光抗体。抗体反响后，洗去未结合的荧光抗体。将待检标本在荧光显微镜下察看，有荧将待检标本在荧光显微镜下察看，有荧光的部位即有相应抗原存在。光的部位即有相应抗原存在。 可用于病毒感染细胞、带某种特异可用于病毒感染细胞、带某种特异抗原的细胞如抗原的细胞如T T细胞和细胞和B B细胞

12、或病原细胞或病原菌的检查，也可用于组织中冷静的免疫菌的检查，也可用于组织中冷静的免疫复合物的检查。复合物的检查。抗原抗原标志抗体标志抗体光原光原荧光荧光直接法原理表示图直接法原理表示图缺陷：检查每种抗原均需制备相应标志的抗体缺陷：检查每种抗原均需制备相应标志的抗体炭疽杆菌炭疽杆菌24h24h培育物直接荧光抗体检测培育物直接荧光抗体检测间接法原理表示图抗原抗原抗体抗体标志标志抗体抗体光原荧光( (一一) )间接法间接法 将抗体将抗体( (一抗一抗) )与标本中的与标本中的抗原结合抗原结合, ,再用再用FITCFITC标志的二抗染色。标志的二抗染色。 2 2、间接荧光法、间接荧光法 将组织或细胞上

13、的抗原直接与将组织或细胞上的抗原直接与相应抗体不标志荧光结合，此相应抗体不标志荧光结合，此为第一抗体，再把能与第一抗体特为第一抗体，再把能与第一抗体特异结合的荧光标志的抗免疫球蛋白异结合的荧光标志的抗免疫球蛋白抗体参与，此为荧光标志的第二抗抗体参与，此为荧光标志的第二抗体，在荧光显微镜下察看荧光。体，在荧光显微镜下察看荧光。 间接法原理表示图间接法原理表示图抗原抗原抗体抗体标志标志抗体抗体光原光原荧光荧光优点：敏感，一种标志抗体可以检测多种抗原优点：敏感，一种标志抗体可以检测多种抗原缺陷：操作繁琐缺陷：操作繁琐3 3、免疫荧光细胞化学、免疫荧光细胞化学 先将知的抗原或抗体标志上荧光素制先将知的

14、抗原或抗体标志上荧光素制成荧光标志物，再用这种荧光抗体或抗原成荧光标志物，再用这种荧光抗体或抗原作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原或抗体。在细胞或组织中构成的抗原抗或抗体。在细胞或组织中构成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜察体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜察看标本，可以看见荧光所在的细胞或组织，看标本，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。用定量技术测定含量。 三、荧光标志抗原三、荧光标志抗原/ /抗体时非特异性抗体时非特异性 染色的主要要素染色的主

15、要要素微生物的原发荧光微生物的原发荧光组织的原发荧光组织的原发荧光游离荧光素及其衍生物的存在游离荧光素及其衍生物的存在抗体不纯抗体不纯抗原不纯抗原不纯染色不当染色不当四、免疫荧光标志技术的运用四、免疫荧光标志技术的运用一定性分析一定性分析 荧光物质特性的光谱包括激发光谱荧光物质特性的光谱包括激发光谱和荧光光谱两种。在分光光度法中，和荧光光谱两种。在分光光度法中，被测物质只需一种特征的吸收光谱，被测物质只需一种特征的吸收光谱，而荧光分析法能测出两种特征光谱，而荧光分析法能测出两种特征光谱，因此，鉴定物质的可靠性较强。因此，鉴定物质的可靠性较强。二定量测定二定量测定 荧光分析法的定量测定方法较多，

16、荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直接测定法和间接测定法两类。可分为直接测定法和间接测定法两类。1 1、直接测定法、直接测定法 利用荧光分析法对被利用荧光分析法对被分析物质进展浓度测定。分析物质进展浓度测定。2 2、间接测定法、间接测定法 有些物质本身不能发有些物质本身不能发光或荧光量子产率低，只能用间接测定光或荧光量子产率低，只能用间接测定法法化学转化法、荧光猝灭法、敏化发光法化学转化法、荧光猝灭法、敏化发光法五、五、 荧光免疫技术实验例如荧光免疫技术实验例如抗细胞核抗体抗细胞核抗体(Antinuclear antibody,ANA)(Antinuclear antibody,ANA) 检

17、测对胶原性疾病检测对胶原性疾病( (如全身性红斑如全身性红斑性狼疮性狼疮) )及其他本身免疫性疾病的诊断及其他本身免疫性疾病的诊断有一定意义。有一定意义。【原 理】 全身性红斑性狼疮全身性红斑性狼疮 (SLE) (SLE)是一种是一种本身免疫性疾病，患者血清中出现本身免疫性疾病，患者血清中出现ANAANA。以大白鼠肝细胞核作为抗原基质，加以大白鼠肝细胞核作为抗原基质，加病人血清病人血清 ( (第一抗体第一抗体) )，再加荧光标志，再加荧光标志的抗人的抗人IgG(IgG(第二抗体第二抗体) )进展间接免疫荧进展间接免疫荧光实验，假设患者血清中有光实验，假设患者血清中有ANAANA，ANAANA便

18、与肝细胞核抗原结合，再与荧光标便与肝细胞核抗原结合，再与荧光标志的抗人志的抗人IgGIgG结合，在荧光镜下可见细结合，在荧光镜下可见细胞核显示黄绿色特异荧光。胞核显示黄绿色特异荧光。【材【材 料】料】1 1、 大白鼠肝组织印片。大白鼠肝组织印片。2 2、 病人血清。病人血清。3 3、 荧光标志抗人荧光标志抗人IgGIgG。4 4、 丙酮、丙酮、PBSPBS、缓冲甘油、缓冲甘油 (PBS+ (PBS+等量甘等量甘油油) )。5 5、 阳性血清和阴性血清。阳性血清和阴性血清。【方【方 法】法】1 1、 将大白鼠肝冰冻印片浸于丙酮中固定将大白鼠肝冰冻印片浸于丙酮中固定5 5分分钟，钟，PBSPBS漂

19、洗三次，每次漂洗三次，每次3 3分钟，取出晾干，分钟，取出晾干，-20-20保管备用。保管备用。2 2 、用、用PBSPBS稀释病人血清，使成稀释病人血清，使成1:51:5、1:101:10、 1 1：201:1280201:1280稀释度。稀释度。3 3、 将不同稀释度的病人血清将不同稀释度的病人血清1010微升微升分别参与鼠肝印片上，放湿盒内，分别参与鼠肝印片上，放湿盒内，置置3737培育箱中培育箱中3030分钟。分钟。4 4、用、用PBSPBS洗去印片上未结合的血清，洗去印片上未结合的血清，然后再用然后再用PBSPBS漂洗三次，每次漂洗三次，每次3 3分钟，分钟，晾干。晾干。5 5、分别

20、滴加适当稀释的荧光标志、分别滴加适当稀释的荧光标志抗人的抗人的IgG(1:10),IgG(1:10),放湿盒内，置放湿盒内，置3737培育箱中培育箱中3030分钟。分钟。7 7、 在染好的玻片上滴加缓冲甘油，荧在染好的玻片上滴加缓冲甘油，荧光镜检。光镜检。6 6、用、用PBSPBS洗去未结合的荧光抗体，然后洗去未结合的荧光抗体，然后再用再用PBSPBS漂洗三次，每次漂洗三次，每次3 3分钟，晾干。分钟，晾干。【结【结 果】果】 整个肝细胞核着色发出黄整个肝细胞核着色发出黄绿色荧光者为阳性绿色荧光者为阳性; ;不发荧光者为阴性。不发荧光者为阴性。 第三节第三节 酶免疫技术酶免疫技术一、一、 酶免

21、疫技术中酶、显色底物和标志物的制备酶免疫技术中酶、显色底物和标志物的制备 在酶免疫技术中用于标志的酶应具有催化在酶免疫技术中用于标志的酶应具有催化活性高、催化专注性强与抗原抗体偶联后不影响活性高、催化专注性强与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体的免疫反响性和酶活性；催化的底物易抗原抗体的免疫反响性和酶活性；催化的底物易于配制、保管且催化底物产生的信号产物易于察于配制、保管且催化底物产生的信号产物易于察看和检测；对人无害且价廉、易得等特点。看和检测；对人无害且价廉、易得等特点。表表1 1 常用酶及底物常用酶及底物常用酶常用酶底物底物加终止液加终止液前颜色前颜色加终止液后加终止液后颜色颜色辣根过氧辣根过

22、氧化物酶化物酶（HRPHRP）RZ3.1RZ3.1碱性磷酸碱性磷酸酶（酶（APAP）邻苯二胺邻苯二胺（OPDOPD）四甲基联苯四甲基联苯胺（胺（TMBTMB）对硝基苯磷对硝基苯磷酸酯（酸酯（p-p-NPPNPP）橙黄色橙黄色蓝色蓝色黄色黄色棕黄色棕黄色黄色黄色黄色黄色二二 标志物的制备标志物的制备标志物制备的方法两类：标志物制备的方法两类： 1 1、交联法、交联法 交联法是以一可同时与酶和抗体交联法是以一可同时与酶和抗体抗原结合的交联剂作为抗原结合的交联剂作为“桥，分桥，分别衔接酶与抗体抗原的方法，此别衔接酶与抗体抗原的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联类方法中目前最常用的是戊二醛交联法

23、，构成的结合物为：酶法，构成的结合物为：酶- -戊二醛戊二醛- -抗抗体抗原。体抗原。2 2、直接法、直接法 直接法是用一活化剂首先将酶直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体抗原结合构成标志接可与抗体抗原结合构成标志物，如过碘酸钠法。物，如过碘酸钠法。 构成的结合物为：酶构成的结合物为：酶- -抗体抗原。抗体抗原。 二、二、 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, (Horseradish Peroxidase, HRP)HRP)标志抗体的制备例如标志抗体的制备例如 一辣根过氧化物酶和底物简介一辣根

24、过氧化物酶和底物简介 Horseradish Peroxidase,HRP Horseradish Peroxidase,HRP 比活性高，稳定，分子量小，纯酶比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。容易制备，所以最常用。 HRP HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量结合而成的糖蛋白，糖含量1818。 底物：邻苯二胺、四甲基联苯胺底物：邻苯二胺、四甲基联苯胺简易过碘酸盐氧化法原理： 辣根过氧化物酶的标志常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸

25、钠将HRP分子外表的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基构成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH (氢硼化钠(或乙醇胺)复原生成稳定的酶标志抗体。 四 操作步骤 1称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。2向溶液中参与0.5ml新配的0.1M NaIO溶液，混匀， 4静置30分钟。3参与0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀， 静置30分钟。4参与含5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5 碳酸盐缓冲液透析，4过夜。5加0.2 mL 新配的5 mg/mL NaBH液，混匀，再置4 , 2h。6在搅拌下逐滴参与等体积饱和硫酸铵，置4 1h。73000 r/min 离心半小

26、时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的PBS中。8 将上述溶液装入透析袋中，对0.15 moL/L pH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000 r/min 离心30 min 去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保管。( (二) )HRPHRP标志抗体的方法 1 1、原理、原理 戊二醛为一种双功能试剂，经过戊二醛为一种双功能试剂，经过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，构成酶基共价结合，构成酶- -戊二醛戊二醛- -免疫球免疫球蛋白结合物。蛋白结合物。2 2、 试剂

27、及器材试剂及器材 (1)0.1M PH6.8(1)0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水磷酸缓冲盐水(PBS)(PBS)：取：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml51ml，NaCl 1.8gNaCl 1.8g，加蒸馏水至，加蒸馏水至200ml200ml。(2)1.25(2)1.25戊二醛液：取戊二醛液：取2525戊二醛戊二醛50ml50ml与与PH6.8PH6.8的的PBS1mlPBS1ml混合。混合。(3)1M PH9.5(3)1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取碳酸盐缓冲液：取1M1M碳酸钠碳酸钠3

28、ml3ml与与1M1M碳酸氢钠碳酸氢钠7ml7ml混合。混合。(4)0.2M(4)0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg29.2mg溶溶于于0.01M PH9.50.01M PH9.5碳酸缓冲液碳酸缓冲液1ml1ml中。中。(5)0.15M PH7.4 PBS(5)0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。及生理盐水。(6)PH7.8(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。液。(7)(7)萘氏试剂及聚乙二醇萘氏试剂及聚乙二醇(PEG(PEG，MW2000)MW2000)。(8)(8)纯化的特异性抗体或抗纯化的特异性抗体或抗IgGIg

29、G抗体。抗体。(9)HRP(RZ3.0)(9)HRP(RZ3.0)。(10)Sephadex G-25(10)Sephadex G-25层析柱层析柱(2cm(2cm50cm)50cm)。(11)(11)搅拌器，分光光度计，离心机。搅拌器，分光光度计，离心机。(12)(12)透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。3 3、标志步骤、标志步骤 (1)(1)称取称取HRP 25mgHRP 25mg溶于溶于1.251.25戊二醛戊二醛溶液中，于室温静置过夜。溶液中，于室温静置过夜。(2)(2)反响后的酶溶液经反响后的酶溶液经Sephadex G-25Sephadex G-2

30、5层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在在1ml/1ml/分钟，搜集棕色流出液。如体分钟，搜集棕色流出液。如体积大于积大于5ml5ml，那么以，那么以PEGPEG浓缩至浓缩至5ml5ml。放。放置置25ml25ml小烧杯中，缓慢搅拌。小烧杯中，缓慢搅拌。(3)(3)将待标志的抗体将待标志的抗体12.5mg12.5mg用生理盐水用生理盐水稀释至稀释至5ml5ml，搅拌下逐滴参与酶溶液中。，搅拌下逐滴参与酶溶液中。(4)(4)用用1M PH9.51M PH9.5碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液0.25ml0.25ml，继续搅拌继续搅拌3 3小时。小时。(5)(5)加加0.2M0

31、.2M赖氨酸赖氨酸0.25ml0.25ml，混匀后，置室，混匀后，置室 温温2 2小时。小时。(6)(6)在搅拌下逐滴参与等体积饱和硫酸铵，在搅拌下逐滴参与等体积饱和硫酸铵， 置置4 14 1小时。小时。(7)(7)3000rpm3000rpm离心离心30min30min，弃上清。沉淀物，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量于少量0.15M PH7.40.15M PH7.4的的PBSPBS中。中。(8)(8)将上述溶液装入透析袋中，对将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.40.15M PH7.4的的PBSPBS缓冲盐水透析，缓冲盐水透

32、析，去除铵离子后去除铵离子后( (用萘氏试剂检测用萘氏试剂检测) )，10000rpm10000rpm离心离心3030分钟去除沉淀，分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保管。冰冻保管。4 4、 结果断定结果断定(1)(1)定性及效价滴定定性及效价滴定: : 用特异性抗原用特异性抗原( (或抗体或抗体) )同酶标志抗体同酶标志抗体( (或抗免疫球或抗免疫球蛋白抗体蛋白抗体) )作双向琼脂分散实验或免作双向琼脂分散实验或免疫电泳实验。疫电泳实验。 然后用酶的底物使沉淀弧显色，然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接可初步鉴定其活性。最后以直接E

33、LISAELISA法法( (或在正式实验系统里或在正式实验系统里) )对酶对酶结合物进展滴定。结合物进展滴定。(2)(2)定量和克分子比值测定定量和克分子比值测定 可用分光光度可用分光光度计测定计测定( (光程光程1cm)1cm)。 酶量酶量(mg(mgml)ml)OD403nmOD403nm0.4 0.4 IgG IgG量量(mg(mgml)ml)OD280nm- OD280nm- OD403nm OD403nm0.42)0.42)0.940.940.620.62 ( (三三) )本卷须知本卷须知 1.1.在具备高质量在具备高质量HRPHRP的条件下，所要标志的抗的条件下，所要标志的抗体也要

34、活性高体也要活性高, ,效价高效价高( (最低最低116),116),纯度高，纯度高，亲和力好，这是保证标志物效价高，免疫亲和力好，这是保证标志物效价高，免疫活性好的首要条件。活性好的首要条件。2.2.所运用试剂的所运用试剂的PHPH和浓度及用量必需严厉和浓度及用量必需严厉掌握。所用试剂，最好掌握。所用试剂，最好( (或必需或必需) )新颖配制。新颖配制。如在戊二醛标志法中所用戊二醛应为新颖如在戊二醛标志法中所用戊二醛应为新颖纯品，因戊二醛储存过久可构成缩和体纯品，因戊二醛储存过久可构成缩和体( (杂杂质质) )。否那么，影响标志效果。否那么，影响标志效果。3.3.室温搅拌时须避光，室内温度普

35、通在室温搅拌时须避光，室内温度普通在2525为宜。标志物每次透析前，须仔为宜。标志物每次透析前，须仔细检查，防止漏液。细检查，防止漏液。4.4.浓的标志物相当稳定，常参与浓的标志物相当稳定，常参与30304040甘油于甘油于-10-10下保管。下保管。44可保管可保管1 12 2年，但稀释成年，但稀释成110110，只能保管数周。，只能保管数周。已配制的运用液应在已配制的运用液应在1212小时内用完。小时内用完。切忌反复冻融。切忌反复冻融。三、酶免疫技术类型和运用三、酶免疫技术类型和运用 酶免疫技术按照抗原抗体系统是定酶免疫技术按照抗原抗体系统是定位于组织细胞上还是存在于液体样品位于组织细胞上

36、还是存在于液体样品中分为酶免疫组化技术和酶免疫测定中分为酶免疫组化技术和酶免疫测定EIAEIA。 酶免疫测定分为酶免疫测定分为 均相酶免疫测定和异相酶免疫测定。均相酶免疫测定和异相酶免疫测定。 1 1、酶免疫加强测定技术、酶免疫加强测定技术EMITEMIT 2 2、克隆酶供体免疫分析、克隆酶供体免疫分析CEDIACEDIA1 1、酶联免疫吸附实验、酶联免疫吸附实验2 2、酶联免疫斑点实验、酶联免疫斑点实验3 3、生物素亲和素、生物素亲和素ELISAELISA4 4、发光酶免疫测定、发光酶免疫测定一均相酶免疫测定一均相酶免疫测定 1 1、酶联免疫吸附实验、酶联免疫吸附实验(enzyme link

37、ed immunosorbent (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) assay,ELISA) 是酶免疫测定中运用最广的技术，用于是酶免疫测定中运用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。测定可溶性抗原或抗体。 将知抗原或抗体吸附在固相载体聚将知抗原或抗体吸附在固相载体聚苯乙烯微量反响板外表，使抗原苯乙烯微量反响板外表，使抗原- -抗体反抗体反响在固相外表进展，借助洗涤将固相上的响在固相外表进展，借助洗涤将固相上的抗原抗原- -抗体复合物与液相中游离成分分别。抗体复合物与液相中游离成分分别。酶标仪酶标仪 (1) (1)间接法：用于测定抗体。先将抗原

38、被覆，间接法：用于测定抗体。先将抗原被覆，洗涤后加待检血清，充分漂洗后参与酶标志的洗涤后加待检血清，充分漂洗后参与酶标志的抗抗体，洗后即可供显色察看。抗抗体，洗后即可供显色察看。 (2)双抗体夹心法：先用抗体(IgG)被覆，加待检抗原，作用洗涤后，加酶标志抗体。3 3竞争法竞争法 即可检测抗原又可检测抗体。它是即可检测抗原又可检测抗体。它是用酶标抗原抗体与待测的非标志用酶标抗原抗体与待测的非标志抗原抗体竞争性的与固相载体上抗原抗体竞争性的与固相载体上的限量抗体抗原结合，待测抗原的限量抗体抗原结合，待测抗原抗体多，那么构成非标志复合物抗体多，那么构成非标志复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就多

39、，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标志复合物少，因此，显色程度是酶标志复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。与待测物含量成反比。竞争法竞争法待测样本待测样本酶标抗体酶标抗体底底 物物终止液终止液2 2、酶联免疫斑点实验、酶联免疫斑点实验(ELISPOT) (ELISPOT) 原理：将抗细胞因子抗体包被固相原理：将抗细胞因子抗体包被固相载体，参与不同来源的细胞，细胞分载体，参与不同来源的细胞，细胞分泌的细胞因子与包被抗体结合，在细泌的细胞因子与包被抗体结合，在细胞周围构成抗体胞周围构成抗体- -抗原细胞因子复抗原细胞因子复合物。合物。 然后参与相应酶标志的抗细胞因子抗体，然后参与相应酶标志

40、的抗细胞因子抗体，经过底物显色反响测定结合在固相载经过底物显色反响测定结合在固相载体上的细胞因子量，并可在光镜下察体上的细胞因子量，并可在光镜下察看分泌细胞因子的细胞。看分泌细胞因子的细胞。 3 3、BAS-ELISABAS-ELISA 生物素生物素biotinbiotin是广泛分布于动、植是广泛分布于动、植物体内的一种生长因子，又称辅酶物体内的一种生长因子，又称辅酶R R或维生或维生素素H H。亲和素。亲和素(avidin)(avidin)是卵白及某些微生物是卵白及某些微生物中的一种蛋白质。生物素与亲和素间具有中的一种蛋白质。生物素与亲和素间具有高度亲和力，且均能偶联抗体、抗原和辣高度亲和力

41、，且均能偶联抗体、抗原和辣根过氧化物酶而不影响其生物学活性。在根过氧化物酶而不影响其生物学活性。在生物素生物素- -亲和素系统亲和素系统(biotin avidin (biotin avidin system,BAS)system,BAS)中，借助所构成的亲和素中，借助所构成的亲和素- -生生物素物素- -酶复合物，追踪生物素标志的抗原或酶复合物，追踪生物素标志的抗原或抗体，经过酶催化底物显色，可检出相应抗体，经过酶催化底物显色，可检出相应抗体或抗原。抗体或抗原。 生物素酶标亲合素系统反响表示图4 4、 发光酶免疫测定发光酶免疫测定 与普通与普通EIAEIA的区别是酶所催化的底物是发的区别是酶

42、所催化的底物是发光剂。产物不是普通光剂。产物不是普通EIAEIA的有色物质，而是的有色物质，而是发光产物，所发出的光可用特定的仪器测定。发光产物，所发出的光可用特定的仪器测定。常用的酶是常用的酶是HRPHRP和和APAP，HRPHRP的发光底物有鲁米的发光底物有鲁米诺及衍生物、对诺及衍生物、对- -羟基苯乙酸；羟基苯乙酸；APAP的底物为的底物为3-3-2-2-螺旋金刚烷螺旋金刚烷-4-4-甲氧基甲氧基-(3-(3-磷酸氧磷酸氧基基)-)-苯基苯基-1-1，2-2-二氧乙烷和二氧乙烷和4-4-甲基伞形酮磷甲基伞形酮磷酸盐。酸盐。四、四、 酶免疫技术实验例如酶免疫技术实验例如酶联免疫吸附实验酶联

43、免疫吸附实验 Enzyme Linked Immunosorbent Enzyme Linked Immunosorbent Assay ,ELISAAssay ,ELISA双抗体夹心法检测双抗体夹心法检测HBsAgHBsAg【原【原 理】理】 以特异性抗体以特异性抗体( (抗抗-HBs)-HBs)致敏载体外致敏载体外表，然后将含有抗原的标本与致敏的表，然后将含有抗原的标本与致敏的载体一同孵育，洗去过量溶液。再加载体一同孵育，洗去过量溶液。再加人酶标特异抗体人酶标特异抗体( (酶标抗酶标抗-HBs)-HBs)。酶标。酶标抗体就衔接到已结合于抗体致敏的载抗体就衔接到已结合于抗体致敏的载体外表的抗

44、原上，孵育后，洗去过量体外表的抗原上，孵育后，洗去过量的结合物。最后加底物溶液，根据颜的结合物。最后加底物溶液，根据颜色反响来断定抗原含量。色反响来断定抗原含量。【材【材 料】料】 HBsAg HBsAg试剂盒，本试剂盒采用双试剂盒，本试剂盒采用双抗体夹心法检测抗体夹心法检测HBsAgHBsAg，适用于血，适用于血清或血浆标本，具有快速简便，特清或血浆标本，具有快速简便，特异性强，灵敏度高，反复性好，所异性强，灵敏度高，反复性好，所需标本量少等优点。需标本量少等优点。试剂盒含试剂盒含: : 1 1、 包被抗包被抗-HBs-HBs反应条反应条1 1板板 2 2、 酶结合物酶结合物 1 1瓶瓶 3

45、 3、 HBsAgHBsAg阳性对照阳性对照1 1瓶瓶 4 4、 HBsAgHBsAg阴性对照阴性对照1 1瓶瓶 5 5、 洗涤液洗涤液: :用前每瓶作用前每瓶作1 1：2020稀释稀释1 1瓶瓶 6 6、 显色剂（显色剂（TMBTMB）A A 1 1瓶瓶 7 7、 显色剂（显色剂（TMBTMB）B B1 1瓶瓶 8 8、 终止液终止液 1 1瓶瓶 【方【方 法】法】 1 1、 加人待测标本加人待测标本 每孔每孔5050微升，并设微升，并设HBsAgHBsAg阳性对照阳性对照2 2孔，孔，HBsAgHBsAg阴性对照阴性对照2 2孔，空白对照孔，空白对照1 1孔，然后参与酶结合物孔，然后参与酶

46、结合物每孔每孔1 1滴滴 (50 (50微升、空白对照孔不加微升、空白对照孔不加) )，充分混匀后置充分混匀后置3737孵育孵育3030分钟。分钟。2 2、 手工洗板：弃去反响条孔内液体、手工洗板：弃去反响条孔内液体、拍干、用洗涤液注满每孔，弃去拍干，拍干、用洗涤液注满每孔，弃去拍干，反复五次后拍干。反复五次后拍干。 ( (洗板机洗板：选择洗涤五次程序洗板，洗板机洗板：选择洗涤五次程序洗板，洗涤液注满每孔，浸泡时间不短于洗涤液注满每孔，浸泡时间不短于2020秒，洗涤程序完成后拍干。秒，洗涤程序完成后拍干。) )3 3、 加显色剂：先加显色剂加显色剂：先加显色剂A A每孔每孔1 1滴滴 (50(

47、50微升微升) )，然后再加显色剂，然后再加显色剂B B每孔每孔1 1滴滴 ( (约约5050微升，混匀，微升，混匀，3737孵育孵育1010分钟。分钟。 【结果判别】【结果判别】 比色法：比色法： 每孔加终止液每孔加终止液1 1滴滴 (50 (50微升微升) )，混匀，混匀，波长波长450nm450nm，先用空白孔校零点，然后，先用空白孔校零点，然后读取各孔光密度值样品读取各孔光密度值样品ODOD值值2.12.1判别判别为阳性，否那么为阴性。为阳性，否那么为阴性。备注：阴性对照平均备注：阴性对照平均ODOD值值 低于低于0.050.05作作0.050.05计算，高于计算，高于0.050.05

48、按实践按实践ODOD值计算。值计算。【本卷须知】1 1、 试剂盒置试剂盒置2288保管。保管。2 2、 运用前试剂应摇匀，并弃去运用前试剂应摇匀，并弃去1 12 2滴滴后垂直滴加。后垂直滴加。3 3、 从冷藏环境中取出试剂盒内全部瓶从冷藏环境中取出试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔条，置室装试剂及待测标本所需微孔条，置室温平衡温平衡3030分钟后再行测试，余者应及分钟后再行测试，余者应及时封存于冰箱中以备后用。时封存于冰箱中以备后用。4 4、 待测标本不可用待测标本不可用NaN3NaN3防腐。防腐。5 5、 不同批号试剂请勿通用。不同批号试剂请勿通用。6 6、 结果判别须在结果判别须在10

49、10分钟内完成。分钟内完成。7 7、 假设浓缩洗涤液出现结晶时，请置假设浓缩洗涤液出现结晶时，请置 3737至溶解。至溶解。 第四节第四节 放射免疫技术放射免疫技术 一、原理与方法一、原理与方法一原理一原理 放射免疫分析法放射免疫分析法radioimmunoassay RIAradioimmunoassay RIA 运用竞争性结合的原理，运用放射性同素运用竞争性结合的原理，运用放射性同素标志抗原或抗体与相应抗体或抗原结标志抗原或抗体与相应抗体或抗原结合，经过测定抗原抗体结合物的放射活性判别合，经过测定抗原抗体结合物的放射活性判别结果。结果。 本方法可进展超微量分析，敏感性高，可用本方法可进展超

50、微量分析，敏感性高，可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。 放射免疫标志技术常用的同位素有放射免疫标志技术常用的同位素有125125和和1311311 1、液相法、液相法 将待检标本例如含胰岛素抗原将待检标本例如含胰岛素抗原与定时的同位素标志的胰岛素抗原与定时的同位素标志的胰岛素抗原和定时的抗胰岛素抗体混合，经一定和定时的抗胰岛素抗体混合，经一定作用时间后，分别搜集抗原抗体复合作用时间后，分别搜集抗原抗体复合物及游离的抗原，测定这两部分的放物及游离的抗原，测定这两部分的放射活性，计算结合率。射活性，计算结合率。 放射免疫分析常用的有液相法和固相法两种放射免疫分

51、析常用的有液相法和固相法两种二方法2 2、固相法、固相法 将抗原或抗体吸附到固相载体外表，将抗原或抗体吸附到固相载体外表，然后加待检标本，最后加标志抗体测然后加待检标本，最后加标志抗体测定固相载体的放射活性。常用的固相定固相载体的放射活性。常用的固相载体有溴化氰载体有溴化氰CNBrCNBr海豹化的纸片海豹化的纸片或聚苯乙烯小管。或聚苯乙烯小管。二、放射免疫分析加样程序二、放射免疫分析加样程序一放射免疫分析顺序饱和加样程序一放射免疫分析顺序饱和加样程序1 1、根本原理、根本原理 先将规范物或血样品与抗血清混匀，免先将规范物或血样品与抗血清混匀，免疫反响疫反响6 624h24h，使抗原与抗体充分结

52、合，使抗原与抗体充分结合，甚至到达平衡，然后再参与标志抗原，与甚至到达平衡，然后再参与标志抗原，与抗体反响抗体反响121224h24h，最后分别，最后分别B B与与F F，这称为，这称为顺序饱和分析法。顺序饱和分析法。 2 2、加样程序、加样程序 以人血浆精氨酸加压素以人血浆精氨酸加压素RIARIA测定程序为例测定程序为例 直接测定。直接测定。1 1加样单位加样单位ll；总反响体；总反响体600l600l。2 2孵育：孵育：44，24h24h。3 3分别分别B B与与F F。无肽血浆，用于血浆的直接。无肽血浆，用于血浆的直接测定。其制备方法为：在电磁搅拌下，抽测定。其制备方法为：在电磁搅拌下，

53、抽取取2%2%加膜活性炭溶液加膜活性炭溶液5ml5ml，共两管，离心、，共两管，离心、去上清。血浆去上清。血浆5ml5ml，倒入上述活性炭管中，倒入上述活性炭管中，加盖，充分振荡加盖，充分振荡10min10min，离心，上清倒入上，离心，上清倒入上述另一活性炭管中，振荡述另一活性炭管中，振荡10min10min，再离心，再离心，取上清，即无肽血浆。取上清，即无肽血浆。二放射免疫分析平衡饱和加样程序二放射免疫分析平衡饱和加样程序1 1、根本原理、根本原理 所谓平衡饱和，是指抗原和抗体所谓平衡饱和，是指抗原和抗体反响到达即不结合，也不解离的平反响到达即不结合，也不解离的平衡形状，称为饱和形状，即平

54、衡饱衡形状，称为饱和形状，即平衡饱和。所以，有人称此为饱和分析法。和。所以，有人称此为饱和分析法。这意味着抗原或被测抗原、标志抗这意味着抗原或被测抗原、标志抗原、抗体三者一同温育。原、抗体三者一同温育。2 2、加样程序、加样程序 普通先加规范物或被测样品，普通先加规范物或被测样品，再加抗血清，最后加标志物。这样再加抗血清，最后加标志物。这样的顺序是让规范物或被测物与抗体的顺序是让规范物或被测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制才干。在小分子半抗原的放射免制才干。在小分子半抗原的放射免疫分析中，标志抗原和未标志抗原疫分析中，标志抗原和未标志抗原与抗体结合的亲合力

55、经常是不一样与抗体结合的亲合力经常是不一样的，前者比后者的亲合力高。的，前者比后者的亲合力高。 以大鼠垂体、下丘脑以大鼠垂体、下丘脑-内啡肽内啡肽RIARIA测定测定程序为例：程序为例：1 1加样单位加样单位ll；总反响体积；总反响体积500l500l。2 2孵育：孵育：44，24h24h。3 3分别分别B B与与F F：每管参与：每管参与2%2%加膜活性炭加膜活性炭溶液溶液300l300l，摇匀，立刻离心，去上，摇匀，立刻离心，去上清，测沉淀清，测沉淀F F的的cpmcpm数。数。三、放射免疫分析的质量控制三、放射免疫分析的质量控制一质量控制的目的和内容一质量控制的目的和内容 1 1、在一个

56、测定方法内产生的误差。、在一个测定方法内产生的误差。 2 2、在同一实验室内不同方法之间产生的误、在同一实验室内不同方法之间产生的误 差。这两种情况属于内部质量控制。差。这两种情况属于内部质量控制。 3 3、用同一测定方法，在各实验室之间产生、用同一测定方法，在各实验室之间产生 的误差。的误差。 4 4、采用不同方法，在各实验室之间产生的、采用不同方法，在各实验室之间产生的 误差。后两种情况属于外部质量控制。误差。后两种情况属于外部质量控制。二产生丈量误差的要素二产生丈量误差的要素三放射免疫分析中丈量误差的控制三放射免疫分析中丈量误差的控制1 1、选择准确性高的方法、选择准确性高的方法2 2、

57、建立方法对比、建立方法对比3 3、建立各种类型的规范。如规定规范品的、建立各种类型的规范。如规定规范品的 纯度、制备方法、运用年限及运用条件纯度、制备方法、运用年限及运用条件4 4、建立操作规程，按规程操作、建立操作规程，按规程操作5 5、建立可靠的检查制度、建立可靠的检查制度四、标志抗原的放射免疫技术四、标志抗原的放射免疫技术RIARIA一原一原 理理 将标志抗原和未标志抗原一同参与相应的将标志抗原和未标志抗原一同参与相应的抗体时那么两种抗原产生相互的竞争，而生成抗体时那么两种抗原产生相互的竞争，而生成有标志抗原和抗体复合物以及非标志抗原和抗有标志抗原和抗体复合物以及非标志抗原和抗体复合物。

58、二者含量在一定限制内呈反比，利体复合物。二者含量在一定限制内呈反比，利用此法可测定未知抗原或抗体。用此法可测定未知抗原或抗体。 抗体为限量的抗体为限量的二放射免疫抗原的制备二放射免疫抗原的制备1 1、完全抗原、完全抗原 为了保证免疫反响的特异性，放射免为了保证免疫反响的特异性，放射免疫抗原纯度必需在疫抗原纯度必需在90%90%以上。通常采用电以上。通常采用电泳、凝胶过滤、离子交换层析等技术获泳、凝胶过滤、离子交换层析等技术获得较高纯度的抗原。得较高纯度的抗原。2 2、半抗原、半抗原 要获得较好的免疫原性，必需将半抗原要获得较好的免疫原性，必需将半抗原与蛋白质大分子的载体结合起来构成一个完与蛋白

59、质大分子的载体结合起来构成一个完全抗原。结合的载体，通常包括血洁白蛋白、全抗原。结合的载体，通常包括血洁白蛋白、 球蛋白、纤维蛋白、甲状腺球蛋白、鸡卵蛋球蛋白、纤维蛋白、甲状腺球蛋白、鸡卵蛋白等白等三抗体的制备与提纯三抗体的制备与提纯 四抗原的标志四抗原的标志1 1、放射性同位素的选择、放射性同位素的选择 选择同位素的原那选择同位素的原那么：么： 方法简单、经济、便于推行运用。方法简单、经济、便于推行运用。 易于防护。易于防护。 同位素与标志物结合好，不易从标志物同位素与标志物结合好，不易从标志物上零落。上零落。 对标志物不引起辐射损伤，使蛋白变性。对标志物不引起辐射损伤，使蛋白变性。 具有较

60、高的计数效率。目前常用的同位具有较高的计数效率。目前常用的同位素有素有3H3H、125 I125 I，其它还有，其它还有14C14C、35S35S和和32P32P等。等。表表1 1 各种标志同位素的性质比较各种标志同位素的性质比较同位素同位素毒性分类毒性分类半衰期半衰期3 3H H1414C C131131I I125125I I3535S S3232P P低毒低毒低毒低毒高毒高毒低毒低毒中毒中毒中毒中毒12.2612.26年年57305730年年8.078.07天天60.2060.20天天67.4867.48天天14.2614.26天天2 2、标志方法、标志方法 目前常用的是碘标志目前常用的