复合皮真皮-表皮连接区结构再生与功能重建

1、    复合皮真皮-表皮连接区结构再生与功能重建        摘要目的：为了解复合皮(CS)真皮-表皮连接(DEJ)区结构再生及其对CS功能重建的作用机制。方法：用经胰蛋白酶处理的异体乳猪真皮与自体表皮重组CS，并以自体表皮为对照(C组)，对移植术后2124周的活检标本作光镜和透射电镜观察。结果：CS组表皮和真皮生长快、成熟早，乳头层组织疏松有序，毛细血管增生迅速，2024周时，乳头和皮钉及以致密板为中心的半桥粒、锚丝、锚纤维等DEJ区结构形成，以靠近毛细血管部位的上述结构

2、再生迅速而密集；C组早期水泡发生率高(P<0.05)，DEJ区缺乏锚丝和锚纤维；至48周时上述结构稀疏而不典型。结论：CS有较好的外观、抗挛缩和耐磨功能与DEJ区结构再生密切相关，异体乳猪真皮具有引导血管再生和正常化作用，加速了DEJ区结构形成和功能的重建。关键词复合皮；真皮-表皮连接；皮肤移植结构；功能中分类号R322.991文献标识码A文章编号1001-7399(2000)05-0397-04Structural restoration and functional reformation in dermal-epidermal junction zone of composite

3、skinJiang DuyingChen BiHu DahaiTang Chaowu（Department of Burns,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xian710032）Shi Yenghui（Center of Electron Microscopy,Department of Basic Medicine,Fourth Military Medical University,Xian710032）ABSTRACTPurposeTo investigate the mechanism of structure r

4、eformation in dermal-epidermal junction(DEJ) zone of composite skin(CS) with allogeneic newborn pig dermis and its significance to functional restoration of CS. MethodsBiopsied specimens from experimental group using CS made of trypsin-treated frozen allogeneic newborn pig dermis and autologous epid

5、ermis(group CS) and control group using autologous epidermis alone (group C) respectively,were observed and compared under the light microscope and transmission electron microscope during the weeks 2 to 124 after graft operation. ResultsThe epidermis and dermis grew faster and matured earlier with l

6、oose and regular tissue structure and rapid rate of angiogenesis in papillary layer in the groups CS. By weeks 20 to 24 after graft operation,the reformation of papillae,dermal ridges and half-desmosomes,anchoring filaments and anchoring fibers converging around the dense laminae appeared in DEJ zon

7、e of group CS occurred with performing more rapidly and densely near the new microvessels. There was a higher incidence of blister in the early stage in the group C(P<0.05),without reformation of anchoring filaments or anchoring fibers which appeared scattering and untypical in DEJ zone until wee

8、k 48 postoperation. ConclusionThe characteristics of the CS,such as good-looking appearance,anti-contracture and tolerance to abrasive force,might closely relate to the structural reformation of DEJ zone. Allogeneic newborn pig dermis could improve the angiogenesis and remodeling of new blood vessel

9、s and subsequently accelerate the structural and functional reformation of DEJ zone.KEY WORDSskin;dermal-epidermal junction;skin transplantation;microscopy,electron复合皮(composite skin,CS)的研制和应用揭开了组织修复学的崭新一页。随着近年来研究的不断深入，国外已有不少学者注意到CS移植后真皮-表皮连接(dermal-epidermis junction,DEJ)区的表皮规范物质钉、真皮乳头、基膜带(BMZ)、锚丝(

10、anchoring filaments)及其锚纤维(anchoring fibrils)等结构再生影响CS质量或功能重建1，2，并有将DEJ区结构再生情况作为评判CS中真皮替代物质量优劣标准的趋势。本研究在猪CS动物模型建立的基础上3，对移植术后2124周的活检标本作组织学和透射电镜的动态观察。1材料和方法1.1CS制作及移植方法以出生2天的7头小白乳猪为异体真皮的供体，无菌条件下剥取全厚皮，用取皮鼓反取厚约0.3 mm的真皮，经抗冻液处理，液氮内贮存。移植前快速复温，用0.25%胰蛋白酶消化脱细胞后备用。选择体重710 kg不同种源健康小白猪作复合皮移植受体，于脊柱两侧各设计70 mm

11、15;70 mm大小的正方形创面3块，每块间隔1.5 cm，取下的全厚皮肤经取皮鼓反取约0.1 mm厚完整自体刃厚皮片，再经0.25%胰蛋白酶内消化，小心分离整张表皮备用。把经酶处理的冷冻异体乳猪真皮与自体表皮重叠(CS组)，一次性移植于受体7头猪的19块创面上，另以相同大小和方法处理的8块自体表皮片(C组)为对照，两组移植部位的机率均等。移植后常规打包包扎，分圈喂养。具体移植方法同文献报道3。1.2一般观察术后2周首次打开创面，常规换药，于2124周观察皮片成活、表面水泡和瘢痕生长和皮片面积(mm2)变化情况(表1)。1.3标本留取两组在上述各时间点(术后24周内，每隔2周)用直径5 mm活

12、检针穿刺留取标本23块，并取附近正常皮肤(NS)作对照。对发生水泡的部位及时留取标本，入4%多聚甲醛缓冲液内固定。1.4DEJ区结构观察方法所有标本常规作HE和VG染色，观察皮钉和乳头等一般结构再生情况。两组各时间点选6个标本按常规方法制作透射电镜(TEM)样本，观察DEJ区BMZ的超微结构变化。其中对术后8周、24周和72周标本统计5个不同视野内DEJ区半桥粒和锚纤维数(表2)，行统计学处理。2结果2.1外观CS组和C组皮片成活率差异无显著性(P>0.05)。57周时，CS和C组分别有16%(3/19)和63%(5/8)的皮片表面有水泡产生，二者相差显著(P<0.001)。CS组

13、表面光滑、柔软(较正常皮肤弹性稍差)，89.7%(17/19)皮片表面无瘢痕，色质正常，随着猪的长大，皮片面积增加。C组表面潮红，手感质韧，凹凸不平，75%(6/8)的皮片有条索状瘢痕增生挛缩。CS组和C组皮片面积变化如表1。2.2组织学观察2.2.1CS组26周内，DEJ界面平坦，真皮浅层毛细血管内皮细胞(VEC)和成纤维细胞(Fb)增生活跃，深层有较多的淋巴细胞和单核细胞浸润。712周，组织炎性水肿逐渐消退，表皮基底细胞(BC)增生，真皮浅层组织疏松，新生的毛细血管长至表皮下。1320周，毛细血管浅 层的BC凸出生长，相邻两个毛细血管之间的BC长入真皮内，分别形成原始乳头和皮钉，真皮深层胶

14、原纤维增粗致密，真皮乳头层和网状层结构清晰可辨。2432周，原始乳头内的VEC和Fb继续增殖，乳头加深，顶部横径扩大，部分乳头相互融合，水平切面上皮嵴呈网状，此期皮嵴、乳头成熟。3672周，乳头和皮钉粗大，表面有皮纹出现，真皮中仍有少数淋巴细胞、巨噬细胞滞留。96周后，上述结构变浅呈退化趋势。2.2.2C组早期大量炎性细胞浸润至表皮下，3周后开始消退，真皮层内可见较多肌Fb呈团索状增生，胶原纤维粗大、密集，排列杂乱，毛细血管稀少。58周，在皮片产生水泡的部位，真皮与表皮分离，泡液内有少量炎性细胞和较多的坏死组织碎片。924周，真皮组织明显增生增厚，浅层虽有少量毛细血管，但血管与表皮之间有致密的

15、基质间隔，皮钉和乳头形成十分缓慢。至72周时，只有稀少粗而浅的不典型皮钉和乳头结构。2.3TEM观察2.3.1正常皮肤真皮浅层结构疏松，基质均匀，胶原纤细，有典型密集的DEJ结构：BC胞浆膜为中心的细胞内张力丝一浆膜不规则凹陷，与BMZ之间构成的半桥粒结构，和以致密板为中心的由来自真皮的细纤维(透明层内锚丝)致密板锚纤维结构，及真皮浅层包含于纤维间隙的胶原纤维、微原纤维和基质。2.3.2CS组2周时已有连续、均一和平滑的BMZ，BC内可见张力丝；36周，真皮浅层结构疏松，BC、VEC和Fb内核染色质、线粒体和粗面内质网丰富，新生胶原纤细；8周时，间隔规律的毛细血管紧邻BMZ，其浅面已有半桥粒及

16、其锚丝，且较其它部位密集。锚纤维最先发生于半桥粒附近；916周，上述结构明显增多，至20周时，已有较完整的DEJ结构形成，半桥粒和致密板增厚，电子密度明显提高，锚纤维、锚丝和微原纤维等结构明显增多，同样乳头内靠近毛细血管部位的DEJ上述结构再生早，成熟快，且锚纤维在BC膜不规则陷凹处浓集。3172周，BMZ增厚，电子密度普遍提高，半桥粒和锚纤维等结构在数量上变化不明显，但特征更加明晰。96周后，上述DEJ结构有退化(电子密度下降，数量减少等)趋势。表1CS组和C组移植后皮片面积变化比较(±s,mm2)组别移植后时间(周)281624365272108124CS3454±(1

17、8) 425*3019±(11)10413644±(11)12415256±(10)10478617±(7)1721*10288±(7)1171*13321±(7)1629*13208±(7)1429*13118±(7)1239*C4237±(7)8783232±(7)6502780±(6)11533700±(6)8925521±(6)14216701±(6)11048037±(6)9798662±(4)10168436±(4

18、)9872检验，CS与C组比较*P<0.05，*P<0.01(注：括号内位皮片块数，未成活皮片未列入)表2CS组和C组DEJ区超微结构再生比较(±s, 阳性结构数/视野，n=6)超微 结构8周24周72周CSCCSCCSC半桥粒2.03±0.62#0.63±0.374.73±0.78*#1.88±0.74*5.06±0.63#2.30±0.79锚纤维1.62±0.65#0.77±0.405.45±1.34*#2.70±0.92*6.35±0.85#3.55

19、7;1.24t检验，#CS组与C组比较，*CS组和C组组内比较；#/*P<0.05，#/*P<0.01，#/*P<0.001 2.3.3C组2周时，BMZ极薄，呈断续状。36周可见胞浆内分别含肌微丝和张力丝的肌Fb和BC增生活跃。718周，真皮浅层新生胶原纤维粗大、致密，少见的毛细血管与BMZ之间有较高电子密度的基质间隔，BMZ增厚、呈片状；在有水泡形成的部位，表皮和真皮自透明层分离，透明层及其深层缺乏锚丝和锚纤维连接。1930周，BC内的张力丝增多，BMZ及其深层基质的电子密度明显增高，锚纤维、微原纤维、半桥粒等结构再生稀疏，至72周时，DEJ结构分布仍不规律，缺乏典型特征

20、。CS组和C组在电镜下半桥粒和锚纤维结构比较见表2。 3讨论CS是一种新型的创面覆盖物，因其具有：永久地覆盖创面；较好的组织弹性，耐磨性和抗挛缩；外观质地似正常皮肤4等优点而倍受各国学者的关注。近年来，越来越多的人把注意力集中于CS结构与功能关系方面的研究，但缺乏系统研究报道。Langdon等1首先利用免疫组化和电镜技术证实，CS移植后95天，BMZ恢复正常水平，锚纤维最先发生于半桥粒附近，水泡形成减少，皮肤功能在细胞和间质的结构重建中已趋于正常，而单纯细胞膜片移植，45月后才见到含型胶原的致密板，锚纤维数量很少，甚至缺失。Hickerson等2，5实验结果显示，CS组偶尔产生水泡，皮色正常，

21、愈合后的皮肤柔软，和传统的断层皮相比，既有耐磨性，又能抵抗创伤的感染，免疫组化和超微结构显示，在真皮底物上移植(培养的)自体表皮加速了皮肤再生，表皮及真皮间的嵴突明显，锚纤维多，表皮角化快，至7个月时，CS组已呈现嵴突，而单纯自体表皮组DEJ区平坦。Langdon等1在CS移植11个月时，组织学仍未见正常起伏的网嵴结构。目前普遍认为，皮肤的弹性、牢固性和抗挛缩性可能与表皮嵴、真皮乳头和BMZ(尤其是锚纤维)结构的完整性有关。DEJ是电镜水平描述皮肤真皮与表皮之间连接的概念6，近年在CS结构与功能关系研究中得到重视，目前尚缺乏统一的评价指标。我们认为，影响CS功能的主要结构因素DEJ，应按光镜和

22、电镜二级水平来进行认识，仅就电镜水平的DEJ结构并不能全面反映影响CS质量的结构因素。光镜水平DEJ结构包括真皮与表皮之间的皮钉、BMZ和乳头；DEJ电镜结构是指由多种超微结构组成的BMZ，包括BC的浆膜、半桥粒、透明带(内含锚丝)、致密板和基膜下纤维带(含锚纤维、微原纤维和胶原纤维)及其纤维间的基质6，7。本实验结果显示，CS组具有较好的弹性、耐磨性和抗挛缩功能，表皮和真皮生长快、成熟早，真皮浅层组织疏松，毛细血管增生迅速，824周DEJ区乳头、皮嵴、BMZ等光镜结构和半桥粒、锚丝、锚纤维等电镜结构再生迅速，24周时上述结构成熟，此后无明显变化。C组24周可见表皮有较多纤维组织，可能与表皮含

23、少量真皮组织、创基残留和深筋膜增生所致。此外，我们发现靠近毛细血管附近的DEJ结构再生快而密集，这可能与BC和VEC均有形成BMZ的能力8及局部营养丰富有关。光镜下BC的基底，锯齿状的BMZ相当于电镜下呈膜状突起产生的裂隙，构成了一个有助于锚纤维1、半桥粒和锚丝等结构再生的微环境。DEJ区结构先于光镜结构的再生，虽不能说具有某种因果关系，但二者相辅相成，构成完整的DEJ的结构因素。正常皮肤真皮与表皮连接最薄弱之处为BMZ中的透明层9。C组58周时，皮片机械脆性增加，易产生水泡，与BMZ缺少锚丝和锚纤维有关。此后，随着上述结构缓慢再生，水泡呈减少趋势，但瘢痕增生明显，主要原因可能与缺少真皮成分对

24、Fb的抑制作用10及其引导性组织再生作用有关11，使Fb过度增殖、胶原和硫酸软骨素等过量沉积，导致毛细血管树型结构和DEJ结构再生受阻。综上所述，决定移植皮片质量或功能的结构基础不仅与锚纤维再生有关1，可能还有DEJ区其它多种结构立体参与，即以乳头、BMZ、皮嵴为代表的光镜结构和以锚纤维、半桥粒、锚丝为代表的BMZ电镜结构。经胰蛋白酶和冷冻处理的异体乳猪真皮具有引导CS早期毛细血管树型结构再生和正常化的作用11，对CS DEJ区结构再生及其功能的有效重建发挥先导作用。基金项目：国家自然科学基金资助项目(No 39070822)作者简介：姜笃银，男，34岁，博士，主治医师作者单位：姜笃银（第四军

25、医大学西京医院烧伤外科）陈璧（第四军医大学西京医院烧伤外科）史颖辉（第四军医大学基础部电镜中心，西安710033）胡大海（第四军医大学西京医院烧伤外科）汤朝武（第四军医大学西京医院烧伤外科）参考文献1，Langdon RC,Cuono CB,Birchall N et al. Reconstitution of structure and cell function in human skin grafts derived from cyopersserved allogeneic dermis and autologous cultured keratinocytes. J Invest Dermatol,1988;91(3):4784