食品科学与工程毕业论文

1、. . . . - 45 - / 62理工大学毕业论文毕业论文题题 目：目：动物组织中硝基呋喃代物残 留量的测定方法 学 院：专 业：食品科学与工程学生：指导教师：毕业论文时间：二 八年二月二十五日六月二十日 共十七周. . . . I / 62摘要用高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法同时测定动物组织与水产品中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代物。盐酸水解动物组织与水产品中蛋白结合的代物，同时加入2-硝基苯甲醛（2-NBA），37过夜衍生化。加入氢氧化钠，调节PH值至7.0后，再加入正己烷去除蛋白。后用乙酸乙酯提取，正己烷净化，分析物采用电喷雾电离正离子（ESI+）、多反应检

2、测（MRM）模式检测，內标法定量。在添加浓度0.52g/kg围，內标法回收率为89.5%110.3%；相对标准偏差（RSD）小于11.3%。5-马啉代甲基-3-氨基-2-恶唑酮（5-methylmorpholino-3-amino-2-oxazolidinone，AMOZ）、3-氨基-2-恶唑酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）、氨基脲（semicarbazide，SEM）和1-氨基-乙酰胺（1-amino-hydantoin，AHD）方法检出限为0.5g/kg。关键词：液相色谱-串联质谱，硝基呋喃类代物，标法. . . . XLV / 62. . . . II / 6

3、2AbstractA high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric method was established for simultaneous determination of the nitrofuran metabolites, furazolidone, nitrofurazone and nitrofurantoin in animals，tissue and aquatic produces. Potein-bound metabolites were released in HCl soluti

4、on and deriatised with 2-nitrobenzaldehyde(2-NBA)overnight at 37. Proteins were sedmentated by n-hexane , after adjusting pH to 7.0 by sodium hydroxide. Then the analytes were extracted by ethyl acetate and cleaned up by n-hexane. Identification was achieved by electrospray ionization in positive mo

5、de(ESI+) using multiple reaction monitoring(MRM).The quantification was performed with internal standards. The recoveries of 5-methylmorpholino-3-amino-2-oxazolidinone (AMOZ), 3-amino-2-oxazolidimone(AOZ), semicarbazide(SEM) and 1-amino-hydantoin(AHD ) were in the range of 89.5%110.3%with spiked lev

6、els of 0.52g/kg. The RSDs were less than 11.3%. The limits of detection were 0.5g/kg for AMOZ, AOZ, SEM and AHD.Keywords:Keywords:Liquid chromatography-tandem mass spectrometric, metabolites of nitrofurans, internal standard. . . . III / 62. . . . IV / 62第第一一章章目目 录录摘 要 .IABSTRACT（英文摘要） . 目 录 .第一章 引言

7、 .11.1 硝基呋喃类药物的性质和使用.11.2 硝基呋喃类药物的危害与其管理对策.21.2.1 硝基呋喃类药物的主要危害.21.2.2 硝基呋喃类药物的管理对策.31.3 硝基呋喃类物质与其代物的样品处理方法.41.3.1 样品的均质 .41.3.2 提取和衍生化 . 溶剂提取 . 水解和衍生化 .51.3.3 样品的净化 . 液液萃取（ LLP） . 基体固相分散技术（ MSPD） . 固相萃取技术（ SPE） . 在线透析和微量富集技术 .71.4 硝基呋喃类物质与其代物的检测方法.81.4

8、.1 色谱分析方法 . 高效液相色谱法 (HPLC) . 联用技术分析法 .101.4.2 分光光度法 .121.4.3 免疫分析法（ IA） .131.4.4 总结 .14第二章 实验方法 .172.1 原理 .17. . . . V / 622.2 仪器和设备 .172.3 试剂与溶液 .182.3.1 主要试剂 .182.3.2 主要溶液的配制 .182.3.3 标准物质和标准溶液 .192.4 实验方法 .202.4.1 试样制备与保存 .202.4.2 分析步骤 . 洗样 . 水解 . 提取和净化

9、. 仪器参数与设定. 液相色谱 -串联质谱测定 . 定性方法 . 定量方法 .23第三章结果计算与讨论 . 243.1 结果计算 .243.2 总离子流图和保留时间 .243.3 样品衍生条件的优化 .253.4 净化条件的选择 .263.5 质谱条件的优化.263.6 检测限、测定低限、回收率和精密度.293.6.1 回收率统计 .293.6.2 重复性统计 .333.7 內标法定量.383.8 标准曲线图谱与线性围.393.8.1 标准曲线图谱 .393.8.2 线性围 .413.9 质量控制与注意事项 .41. .

10、. . VI / 623.9.1 质量控制 .413.9.2 注意事项 .42结论 .44参考文献 45致与声明 48. . . . - 1 - / 62第一章 引 言1.11.1 硝基呋喃类药物的性质和使用硝基呋喃类药物的性质和使用硝基呋喃类药物(Nitrofurans)是人工合成的具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫均有作用，在低浓度下对上述病原体有抑制作用，高浓度则有杀灭作用，其抗菌作用机理是干扰细菌体的氧化还原酶系统，使细菌代紊乱1。硝基呋喃类抗生素主要包括呋喃唑酮(Furazolidone)、呋喃它酮(Furaltadone)、呋

11、喃西林(Nitrofurazone)、呋喃妥因(Nitrofurantoin)等，见图1-1，呋喃类物质均为性质稳定的黄色粉末，无味或味微苦。呋喃西林难溶于水(1:4200)，微溶于乙醇(1:590)，呋喃唑酮几乎不溶于水和乙醇；呋喃妥因几乎不溶于水，微溶于乙醇。图1-1 四种硝基呋喃代物结构式. . . . - 2 - / 62这类抗生素因其具有抑菌性和杀菌性而广泛用于家禽、家畜、水产、蜂等动物传染病的预防与治疗，部分品种具有促生长的作用，可用作饲料添加剂。呋喃类药物服后，吸收较少，吸收的部分在体迅速被破坏，血药浓度低，不易达到有效浓度，不宜用于全身感染的治疗。其中呋喃唑酮服后难吸收，肠中浓

12、度高而血中浓度低，故适用于各种肠道感染的治疗，呋喃唑酮可用于治疗小儿菌痢、伤寒、消化性溃疡等疾病，呋喃唑酮的复方缓释制剂是卫生部批准的抗HP(HP是胃溃疡的主要致病菌)感染的药物。呋喃唑酮用于防治水生动物疾病，如用1g/kg2g/kg防治观赏鱼蛀鳍烂尾病和罗非鱼溃烂病。呋喃唑酮用于罗氏沼虾、鳗鲡、对虾和河蟹等水生动物养殖环境的消毒药物。呋喃唑酮用于防治畜禽肠道感染，如兔球虫病、猪痢疾、禽白痢、火鸡黑头病等2。呋喃妥因服吸收较快，体消除快，此药由尿的排出量大，故主要用于治疗尿道感染；而呋喃西林在本类药物中毒性最大，主要用作局部或创伤的感染的外用消毒剂。1.21.2 硝基呋喃类药物的危害与其管理对

13、策硝基呋喃类药物的危害与其管理对策1.2.1 硝基呋喃类药物的主要危害（1）对畜禽有毒性作用。大剂量或长时间应用硝基呋喃类药物均能对畜禽产生毒性作用，其中呋喃西林的毒性最大，呋喃唑酮的毒性最小，为呋喃西林的1/10左右。在硝基呋喃类药物中，以呋喃西林对家禽的毒性作用最常见，尤其是雏鸭和雏鸡，以220mg/kg混饲喂雏鸭或以400mg/kg混饲喂雏鸡，连续用药10天以上，出现呆滞、羽毛蓬松、厌食或兴奋、惊厥症状，最后死亡。兽医临床上经常出现有关猪、鸭、羊、鸽子等呋喃唑酮中毒的事件报道。（2）具有致癌致畸致突变。呋喃它酮为强致癌性药物，呋喃唑酮具中等强度致癌性。通过对小白鼠和大白鼠的毒性研究表明，

14、呋喃唑酮可以诱发乳腺癌和支气管癌，并且有剂量反应关系；高剂量饲喂食用鱼和观赏鱼，可诱导鱼的肝脏发生肿瘤；繁殖毒性结果表明，呋喃唑酮能减少精子的数量和胚胎的成活率。硝基呋喃类化合物是直接致变剂，它不用附加外源性激活系统就可以引起细菌的突变。（3）代产物对人体危害严重。硝基呋喃类药物在体代迅速，代的部分化. . . . - 3 - / 62合物分子与细胞膜蛋白结合成为结合态，结合态可长期保持稳定，从而延缓药物在体的消除速度。用呋喃唑酮对种鸡进行处理以后，代物残留将按种鸡-种蛋-雏鸡-成鸡的生物链条传递。普通的食品加工方法(如烧烤、微波加工、烹调等)难以使蛋白结合态呋喃唑酮残留物大量降解。这些代物可

15、以在弱酸性条件下从蛋白质中释放出来，因此，当人类吃了含有硝基呋喃类抗生素残留的食品，这些代物就可以在人类胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来被人体吸收而对人类健康造成危害。动物肝脏为主要的药物代器官，蛋白质结合态的残留药物主要累积在肝脏。1.2.2 硝基呋喃类药物的管理对策由于硝基呋喃类药物残留危害严重，美国、日本和欧盟等国家和地区纷纷采取措施，严加监管。欧盟(EU)从 1997 年开始将所有的硝基呋喃类抗生素全部列为违禁药物。1990 年 7 月欧盟颁布 2377/90/EEC 条例，将硝基呋喃类药物与其代产物列为 A 类禁用药物，规定其在动物源性食品中的残留检测限为1.0g/kg3。由于对呋

16、喃唑酮蛋白结合态残留物的安全性产生怀疑，自 1995年起欧盟全面规定禁止使用呋喃类抗菌物质，在动物源性食品中呋喃类残留物的检出限为不得检出。欧盟(EU)N0807/2001 法规中，规定使用 HPLC 方法检测呋喃唑酮，检测限量 2ng/kg4ng/kg。2004 年美国 FDA 公布了禁止在进口动物源性食品中使用的 11 种药物，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。我国农业部文件农牧发2002号也规定动物源性食品中呋喃唑酮的检出限为不得检出。美国 21CFR530.41 规定：食源性动物禁止使用呋喃唑酮和呋喃妥因。国 2002 年版食品公典规定猪肉中不得检出呋喃唑酮。欧盟EEC2377/90 规定动

17、物源性食品中不得检出硝基呋喃(包括呋喃唑酮)。2002 年4 月，我国农业部第 193 号公告(食品动物禁用的兽药与其它化合物清单)将硝基呋喃类药物列为禁止使用的药物。我国目前使用行业标准 SN05301996 出口肉品中呋喃唑酮残留量检验方法:液相色谱法，检测限量 0.1g/kg4-5。2003 年开始，我国将硝基呋喃纳入残留监控计划中。但是硝基呋喃类药物残留超标事件时有发生，严重危与动物源性食品安全和出口，因此，必须进一步强化对硝基呋喃类药物的管理。. . . . - 4 - / 62（1）加强培训与宣传，提高安全用药意识。要广泛宣传畜禽健康养殖知识、国家安全用药的有关法律法规和药物残留对

18、人类健康的危害性，让广大养殖者了解使用禁用药后产生的危害与法律后果，提高养殖者的法律意识和安全用药的自觉性。（2）加强兽药生产经营管理。严格按照兽药管理条例、兽药生产质量管理规GMP和兽药经营管理规GSP的要求规生产经营行为，加大对生产、经营企业的监督管理，严厉查处生产、经营禁用药的行为。（3）加强饲料生产管理。加强对饲料生产企业的监控，严禁使用农业部规定以外的兽药作为饲料添加剂。饲料生产企业要加强对生产原料的管理，做到原料来源清楚，记录明确；要加强对原料检测，重点加强对鱼粉原料的检测；要防止含有硝基呋喃类药物的饲料原料投入生产，防止在生产过程中污染违禁药物。（4）加强畜禽养殖的管理。养殖过程

19、是兽药残留监控的关键环节，养殖者是动物源性食品安全的主体，其安全用药与否直接关系到食品安全。养殖场应当建立养殖档案，载明饲料、饲料添加剂等投入品和兽药的来源、名称、使用对象、时间和用量等有关情况，禁止使用硝基呋喃等违禁药物。（5）加强兽药残留监控。加大投入，尽快建设完善我国动物源性食品的兽药残留监控体系，形成国家、省、市、县完整的兽药残留检测网络梯级结构；加快我国兽药残留监控检测方法的研究步伐，发展简单快速准确灵敏的分析技术；加强对生产、加工和流通环节的监管，加大对养殖场、加工厂和农贸市场等畜禽与产品的抽样检测力度。1.31.3 硝基呋喃类物质与其代物的样品处理方法硝基呋喃类物质与其代物的样品

20、处理方法样品的处理通常包括均质、提取、净化、衍生化等步骤，以达到释放残留物特别是蛋白结合残留物、去除干扰基质、浓缩目标分析物的目的。1.3.1 样品的均质 取样时，通常仅取可食部分，并注意具有代表性。对于虾类样品的处理，先粉碎均匀，再冷冻储存，但对其他肌肉组织、肾脏和肝脏等样品，需要先冷冻，. . . . - 5 - / 62后选择有代表性部分切成薄片，再进一步粉碎。尽量避免将整个样品一次均相，引起酶的活性增加，从而造成分析物的损失。粉碎后的样品，用水、氯化钠溶液或盐酸溶液混合均相；奶类和蜂蜜等样品的处理，可直接用水或盐酸溶液混合均匀。1.3.2 提取和衍生化 溶剂提取在样品的提

21、取步骤，要求能够将动物性食品中的硝基呋喃残留物释放至溶液中，一般使用水和酸化的有机溶剂，以达到去除大部分蛋白质和萃取残留物的目的。在样品的提取和去蛋白过程中，有机溶剂也能从源性大分子中萃取非共价键结合的残留物。常用的有机溶剂包括乙腈、乙酸乙脂、二氯甲烷等。除此之外，三氯乙酸、甲醇/乙醇/二乙醚、Mcllvaine 缓冲溶液/甲醇、偏磷酸/甲醇、柠檬酸/磷酸氢二钠、氯仿/乙酸乙脂/二甲基亚砜都有应用的报道。 水解和衍生化对于硝基呋喃代物的测定，鉴于其残留物主要以蛋白结合物形态存在，只有在适当的酸性条件下经水解过程，才能释放出游离代产物，而且因残留物的浓度一般非常低，需要采用衍生化手

22、段提高灵敏度，故样品的处理需要水解和衍生化。通常水解选用稀盐酸，浓度为 0.1mol/L。对衍生化试剂的选择，许多研究者对此进行了大量的探索，芳香醛类如 2-硝基苯甲醛（2-NBA） 、吡啶-3-羰基甲醛、2，4-二硝基苯甲醛、2-羟基-5-硝基苯甲醛和 2-氯苯甲醛，均能与硝基呋喃游离代产物的自由氨基团反应，形成具有较好特性的芳香亚胺类衍生物。2-NBA 是采用最多的衍生化试剂，该类衍生物在色谱柱上有较好的保留，在质谱仪上有特征的离子碎片，灵敏度高。以呋喃唑酮为例，肌肉组织在酸性条件下被水解，产生游离代产物 AOZ 与2-NBA 发生衍生化反应，生成性质稳定的衍生物，该衍生物有紫外吸收，并可

23、储存于-18冰箱数周不变。同样地，呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因的蛋白结合代物，经酸水解，产生游离代产物 SEM、AMOZ 和 AHD。. . . . - 6 - / 62SEM、AOZ、AHD 和 AMOZ 的相对分子质量分别为75.1、102.1、115.1、201.1，在此质量围，MS 噪音大，加上分析物较低的离子化效率和无特征的碎片行为，MS 检测灵敏度很低，给定量特别是定性带来困难。通过采用 2-NBA 进行衍生化，使得上述代物的衍生物NPSEM、NPAOZ、NPAHD、NPAMOZ 相对分子质量分别达到208.2、248.2、235.2、334.3，在适当的碰撞电压下均产生不少于两个

24、特性离子的碎片峰，MS 检测灵敏度提高，更适合于质谱的定性和定量。值得注意的是，许多细胞大分子也含有可反应的氨基，需加入远远过量的2-NBA 来确保由蛋白结合残留释放出的自由代产物全部衍生化。1.3.3 样品的净化通常，得到的水提取液或有机提取液中，目标分析物浓度较低，还含有许多共萃取基质，如果这些物质在最终的溶液中存在，不仅会干扰检测，也会增加背景噪声，无法测定痕量浓度的目标分析物。样品净化的目的就是为了减少萃取中的共萃取基质，浓缩目标分析物。常用的净化技术包括传统的液液萃取（LLP） 、固相萃取（SPE） 、基体固相分散技术（MSPD） 、在线透析和微量富集技术。在实际分析中，结合多种净化

25、和浓缩技术来减少检测的背景噪声，以达到定量分析微量残留物的应用也很常见。 液液萃取（LLP）液液萃取是最经典、常用的净化手段，可以用有机溶剂将待测物从溶液中萃取出来，或者将干扰物质从有机相或水相萃取物中除去。实验证明，在酸性条件下，乙酸乙脂、二氯甲烷对溶液中的硝基呋喃残留物萃取效果好，也有加入氯化钠以进一步提高二氯甲烷萃取效率的报道。为了达到更好的净化效果，正己烷常被用于对样品萃取液的进一步脱脂。液液萃取的优点是成本低，不需要特殊的实验设备，其缺点是在萃取过程中有时产生乳化现象，且有机溶剂消耗量大。 基体固相分散技术（MSPD）基体固相分散技术是将硅藻土或非极性的

26、C18衍生硅胶等作为吸附剂，加. . . . - 7 - / 62入到样品中，混合均匀，或者样品与吸附剂一同研磨，然后把搅拌均匀的物质填充到层析柱中，用溶剂淋洗，达到净化的目的，该技术可以克服液液萃取过程中产生乳化的问题。K.Yoshida6等和 L.H.MVroomen7等报道了硅藻土的应用，A.R.Long8等利用非极性的 C18衍生硅胶等作为吸附剂，成功地净化了奶中的呋喃唑酮。 固相萃取技术（SPE）固相萃取技术是一种色谱净化技术。将含待测物的溶液通过吸附层，使待测物保留在吸附层，经洗脱除去杂质，再选用合适的溶剂洗脱并收集目标分析物。用固相萃取柱可以从共萃取物中净化和浓缩硝

27、基呋喃萃取物。有学者报道用非极性吸附剂如反相 C18或者 XAD-2 可获得高的回收率，然而在许多情况下，非极性吸附剂在从萃取物中除去干扰物的净化过程并不理想，一些极性吸附剂例如硅胶、氧化铝或者氨丙基材料也常常被采用，以达到更好的萃取净化效果。 SPE 柱有多种，如 Phenomenex SDB-L 反相聚合的苯乙烯-二乙烯基苯柱，基于共聚物憎水性和 - 共轭键的相互作用，该柱对硝基呋喃有很强的选择性保留，而大多数基质干扰物保留较弱，能保留、洗脱硝基呋喃的 4 种待测物，效果很好。LiChrolut EN 和 SDB-L 柱可以提供相似的结果，但保留特性有少许差别。其他可供选择的柱还有如 Wa

28、ters Oasis HLB SPE、Varian Bond Elut ENV/LMS、Supelco Supelclean Envi-Chrom P、JT Baker Bakernond H2O-phobic DVB、IST Isolute101 等。净化过程包括柱子活化、淋洗和洗脱。SPE 的特点包括稳定可靠，有更好的重现性和高的回收率，不会产生不溶现象，可消除乳化，减少溶剂的使用，可用于大围的不同基质。此外，还容易自动化，如自动化的 SPE：ASPEC，为满足不同样品萃取量的需求，有各种不同体积的柱子可供选择，包括碟式萃取片。此外，高通量的 96 孔板，可满足处理大量样品的要求。1.3.

29、3.4 在线透析和微量富集技术M.M.L.Aerts9等报道在线透析和微量富集技术应用于动物源性食品肉类、奶类和蛋类中硝基呋喃的分析。方法用双相透析膜将待测物在线分离，然后用. . . . - 8 - / 62液相色谱柱（Bondapak C18/Corasil，3750m，或者 XAD-4，50100m）将4 种硝基呋喃预富集，先将共萃取的基质淋洗至废液中，再将浓缩的分析物冲到分析柱上分离，用紫外检测器检测，可达到 15g/kg 的检出限。1.41.4 硝基呋喃类物质与其代物的检测方法硝基呋喃类物质与其代物的检测方法在国外已经发表有关硝基呋喃类抗生素的残留检测方法的文献中，早期的文献报道大多

30、数是检测原药化合物。然而由于硝基呋喃类抗生素对光敏感，具有代快速的特点，在动物体的半衰期不过数小时，通常不太可能检出原药的残留，例如呋喃唑酮在停药后12h从组织中消失，而其代物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)在动物体则以组织蛋白结合物的形式存在，在体可残留数周，在停药后至少6周AOZ在猪肌肉组织中继续存在10，因此当原药浓度降至检测限以下时，检测其代物浓度是可能的。其他硝基呋喃类抗生素也有类似特性。现在各研究机构已开始关注其代物的检出，国外报道过用于检测硝基呋喃类抗生素与其代物残留的方法主要有色谱分析方法与其联用技术、分光光度法、免疫分析法等。1.4.1 色谱分析方法高效液相色谱法(HPLC)

31、在硝基呋喃类抗生素的检测中比较常见，HPLC法所用的检测器文献报道较多的有紫外检测器(UV，包括二极管阵列检测器DAD)和电化学检测器(ECD)。近年来各种色谱联用技术分析法在硝基呋喃类抗生素的代物的检测中应用较多，发展迅速，主要是与质谱联用（包括串联质谱）。 高效液相色谱法 (HPLC)（1）液相色谱-紫外检测器(LC-UV)在硝基呋喃类抗生素原药化合物的检测中高效液相色谱应用最多，而高效液相色谱最常用的检测器就是紫外检测器(UV，包括二极管阵列检测器DAD)。通常用高效液相色谱结合紫外检测器测定硝基呋喃类药物代物时，因为呋喃结构的紫外光谱吸收不明显，导致灵敏度过低，不能满足出

32、口产品检测硝基呋喃类代产物残留限量的要求11。经衍生化试剂衍生化后，产生强紫外吸收，其检测限可以达到1g/kg，但是复杂的基质会导致测定困难和干扰。AngeliniN.M.等. . . . - 9 - / 6212利用LC-UV方法检测牛肌肉组织中四种硝基呋喃类药物的残留，方法的检测限是1mg/kg，定量限是2mg/kg，平均回收率76%。我国农业部于2001年11月1日发布农牧发200138号文件，发布了10种动物源食品中兽药残留检测方法，其中呋喃唑酮的检测方法就是高效液相色谱法(紫外检测器)。这个标准方法适用于鸡的肌肉、肝脏、肾脏组织和鱼肉中呋喃唑酮残留量的检测，在鸡的肌肉组织、肝脏、肾脏

33、、鱼肉组织中的检测限分别为10、50、50、25g/kg，回收率分别为80%110%、60%130%、50%140%、70%120%。本方法的批变异系数CV10%，批间变异系数CV25%。宝坤等13采用固相萃取(SPE)前处理净化技术，高效液相色谱(配有紫外检测器)法快速测定鸡肉、鱼、虾中呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮药物残留量，4种硝基呋喃类药物在鸡肉、鱼、虾样品中3个不同水平的添加回收率(n=7)为87%102%；相对标准偏差(RSD)为2.0%7.8%；工作曲线的线性围为5g/kg100g/kg；呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮的检出限分别为5、2、3、2g/kg。于慧娟等

34、14利用高效液相色谱法(配有紫外检测器)测定水产品中呋喃唑酮的残留量，其方法灵敏度高，检测限为1.0g/kg。由此可见，高效液相色谱(紫外检测器)检测硝基呋喃类抗生素的方法已逐渐趋于成熟，灵敏度不断提高，检测限能满足国外水产品中微量呋喃唑酮测定的要求。（2）液相色谱-电化学检测器(LC-ECD)电化学检测器(ECD)因其高灵敏性也在硝基呋喃类抗生素的检测中得到应用。Owen W.Parks和Leon F.Kubena15利用LC-ECD(工作电极为玻碳电极，工作电位-0.8V，参比电极为Ag/AgCl电极)检测用含有呋喃唑酮的饲料喂养的鸡的肝脏和胸部肌肉组织中的呋喃唑酮的残留。T.Galean

35、oDiaz等16利用HPLCECD(库仑法)来检测牛奶中的呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮。样品经提取净化后，以MeCN0.1mol/L-1mol/LNaClO4(2872)和0.5%的冰醋酸为流动相，在Nova-PakC18柱上分离，Coulochem检测器检测(工作电极为多孔石墨电极，工作电位-600mV)。标准曲线的线性良好，线性围在1060ng/ml。其中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因测定结果的相关系数r分别为. . . . - 10 - / 620.9948、0.9268、0.9967(Height)和0.9930、0.9970、0.9975(Area)。相对标准偏差(n=11)分别为1.

36、3%、1.6%、1.6%(Height)和2.1%、3.6%、1.9%(Area)，检测限分别为5、4、4ng/ml(Height)和6、4、4ng/ml(Area)。在4、10、25ng/ml的添加回收率分别为(8511)%(979)%、(871)%(976)%、(834)%(989)%。Alawi-MA17利用改进的HPLC/ELCD高效液相色谱电化学检测器检测鸡组织和鸡蛋中的呋喃唑酮和盐酸呋喃它酮。其回收率在80.0%99.0%。呋喃唑酮的检测限为1ng/g，盐酸呋喃它酮的检测限为2ng/g。 联用技术分析法（1）液相色谱-质谱法(LC-MS)色谱技术广泛应用于多组分混合物

37、的分离和分析，特别适合有机化合物的定量分析，但定性较困难；质谱仪只能够对单一组分提供高灵敏度和特征的质谱图，但对复杂化合物分析无能为力。将色谱和质谱技术进行联用，对混合物中微量或痕量组分的定性和定量分析具有重要意义18。近些年来，高效液相色谱配合质谱技术(LC-MS)测定硝基呋喃类代物在动物组织中的残留越来越多被采用，与用紫外检测器的检测方法比较，质谱检测器技术具有定性、定量准确，抗干扰能力强，检测限低，测定快速等特点17。对被测化合物的确认有很高的可信度，具有灵敏度高(比UV检测器高10倍以上)、选择性好、精密度高等优点，而且HPLC-MS有易于操作和自动化的特点。LC-MS法可以利用待测分

38、子的结构来定性，可以排除酶联免疫方法和HPLC法检测的假阳性结果，用以确证检测结果。目前HPLC-MS连用技术已经成为制药业、药物分析与研制等领域十分重要的分析方法，在环境分析中也起着重要作用，同时也是生物化学和生物技术大量使用的工具。近几年国外采用HPLC-MS对各种药物与其代物的研究取得了一定的进展。荷兰瓦郝尼罕RIKIL T-DLO实验室建立了完整的LC-MS法检测呋喃唑酮代物AOZ与其他代物19。HorneE等进一步对该方法进行改进，利用SPE简化了衍生后的呋喃唑酮代物NPAOZ的提取过程，再用LC-MS法进行定性分析，对检测猪肝中呋喃唑酮代物AOZ的不同方法进行比较研究，表明利用HP

39、LC法和LC-MS法测定AOZ的结果基本一样20。Rosa Draisci等32利用HPLC-DAD(光二极管阵列检测. . . . - 11 - / 62器)检测鸡蛋中硝基呋喃类药物残留并用HPLC-MS进行确认。呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮利用HPLC-MS方法检测限分别为3.2、1.6、1.0g/kg。Robert J.McCracken和D.Glenn Kennedy21提出一种用HPLC-UV和LC-MS方法检测动物性食品中硝基呋喃类抗生素呋喃唑酮。在溶解提取物用铝土柱净化后，用HPLC-UV筛选可能含有呋喃唑酮的样品，LC-MS方法用来确定证实阳性样品。Robert J.Mc-Cr

40、acken和D.Glenn Kennedy20利用LC-MS方法测定猪组织中呋喃唑酮的代物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)，组织样品先用甲醇-水反复溶解洗涤并用2-硝基苯甲醛衍生化后分析测定。肝脏和肌肉组织的检测限为10ng/g，回收率大于80%。用此方法在北爱尔兰猪呋喃唑酮残留事件中对100个猪肾脏样品进行了测定，7份浓度在15ng/g之间，4份小于1ng/g，还有1份达到144ng/g。目前，HPLC、LC-MS相关联的NPAOZ提取方法已经得到改良，并通过一系列的加标样品研究得以验证。徐维海等采取LC-MS法研究呋喃唑酮与其主要代产物AOZ在罗非鱼体的残留规律，利用该方法对呋喃唑酮与其代

41、物AOZ的检出限分别为10、1g/kg22。由此可见LC-MS是一种灵敏度高、选择性好、特异性强、快速的分析确证硝基呋喃类药物残留的方法。但是其仪器设备的购置和运行费用较高，成为常规分析方法尚有一定距离。（2）液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)最近几年用于检测硝基呋喃类抗生素的代物的LC-MS/MS方法发展迅速，它是一种灵敏度更高、选择性更好、特异性更强的一种方法，欧盟目前认为HPLC-MS只能用于对硝基呋喃代产物进行筛选实验，对检出的阳性结果必须再用LC-MS/MS进行确证。欧盟EEC/657/2002指令规定对于禁用药物的质谱确证方法必须达到四个确证点(一个质谱离子为一个确证点)。显

42、然，并非所有的残留检测实验室都具备HPLC-MS/MS仪器条件4-5。目前许多国家已将LC-MS/MS方法作为检测硝基呋喃类抗生素的代物的确证性方法。Alexander Leitner等23提出用LC-MS/MS方法同时分析动物肌肉组织中四种硝基呋喃类抗生素的代物的方法。被分析物被酸性水解从组织中释放，用2-硝基苯甲醛衍生化，利用固相萃取(SPE)将样品净化。四种硝基呋喃类抗生素代物AOZ、AMOZ、SC、AH的检测限. . . . - 12 - / 62分别是0.5、0.5、3.0、5.0ng/g，定量限分别是2.5、2.5、10.0、10.0ng/g，测定响应值的线性围从检测限到800ng

43、/g之间。M.OKeeffe等24也利用LC-MS/MS方法对来自欧洲15个国家的1500个市场购买的猪肉样品进行四种硝基呋喃类抗生素的代物残留的检测，方法的定量限分别是0.1g/kg(AOZ、AMOZ)、0.2g/kg(SC)、0.5g/kg(AH)，在1500个样品中检测出12份样品有代物残留，并得以确证。Pascal Mottier等25利用LC-MS/MS方法，电喷雾电离(ESI)，标法定量检测肉中4种硝基呋喃类抗生素的代物，方法的判定限CC值为0.110.21g/kg，检测能力CC值为0.190.36g/kg，低于欧盟规定的1g/kg的最低检测限量的要求。涛等11利用LC-MS/MS

44、方法同时测定动物肌肉组织中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代物。定量限AMOZ、AOZ均为0.1ng/g，SC、AH均为0.5ng/g；检测限AMOZ、AOZ均为0.05ng/g，SC、AH均为0.1ng/g。在添加浓度0.510ng/g围，AMOZ回收率为65.4%91.3%，SC回收率为62.7%94.6%，AH回收率为63.9%89.4%，AOZ回收率为67.8%90.9%，相对标准偏差(RSD)均小于4.8%。余建新等26采用微量化样品前处理技术，以邻硝基苯甲醛为衍生剂，电喷雾正离子多反应监测方式建立了蜂蜜与水产品中4种硝基呋喃类抗生素代物残留量同时测定的液相色谱一串联质谱联方

45、法。方法的检出限为0.020.3ng/g，线性围均102，线性方程的相关系数r0.997，回收率为79.0%95.6%。目前，我国已将液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)作为测定蜂蜜中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代物残留量的标准测定方法(GB/T18932.24-2005)，从2005年8月1日开始实施。1.4.2 分光光度法分光光度法主要是用来测定动物饲料中呋喃唑酮等硝基呋喃类药物添加剂。廖峰等27利用分光光度法测定饲料中的呋喃唑酮，这种方法是将饲料试样中的呋喃唑酮用二甲基甲酰胺(DMF)提取出来，使其与苯肼盐酸溶液反应，产生亮黄色的反应物，再用甲苯萃取后，在440nm处用分光

46、光度计读取其吸光值，从而进行测定。此方法测定简便，线性相关系数r0.999，试样回收率在95%102%之间。Bautista-Ordonez-JA等28利用分光光度法测定出售的鸡饲料中的呋喃西林和呋喃唑酮的浓度，并检测到饲料中有呋喃西林和呋喃唑酮的存在。分光光度法可以判定动物性产品中是否存在硝基呋喃类药物，且该法不需昂贵的仪器. . . . - 13 - / 62与试剂，也没有复杂的样品前处理，操作简单，对于硬件设备不够完善的质检部门和生产企业有较好的推广与应用价值，但测定结果准确度不高，最低检测限较高，灵敏度低，不能作为确证性方法。1.4.3 免疫分析法（IA）国外关于硝基呋喃类抗生素的免疫

47、分析方法的报道很少。现有的文献报道的方法也只有酶联免疫分析法（ELISA方法，ELISA方法的优点是灵敏度高、操作简便、检测迅速；缺点是仍不能实现在线检测，而且假阳性率较高。罗杰、健29建立了呋喃唑酮间接竞争ELISA检测法，将呋喃唑酮与牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)联接，分别作为免疫原与包被原，建立了水产养殖动物组织中呋喃唑酮的ELISA筛选方法，测定的最适围为10100ng/ml，最小检测限为1ng/ml。ELISA方法的孔间差异为4.16%，板间差异为9.20%，实验重复性好，添加回收率试验测得虾肉样本平均回收率为(94.869.55)%，在试验浓度围，呋喃唑酮的抗血清与

48、呋喃西林的交叉反应性为43%，与其他药物未显示免疫交叉反应性。竞争性酶联免疫法(ELISA)测定的基础是抗原抗体反应(双抗体反应)。所涉与的设备有组织捣碎机、微孔板酶标仪(450nm)、离心机、振荡器、旋转蒸发器、磁力搅拌器、微量加样器、多道移液器、混合器(旋转后超声)等。各种硝基呋喃类物质代物中以AOZ较为典型，以此为例。其原理是：将被测样本中的结合代残留物经水解、衍生形成NPAOZ，其与过氧化物酶标记的NPAOZ竞争结合有限的NPAOZ抗体(竞争性酶免疫分析)，同时此抗体又与包被在微孔板条上针对它的抗体结合，经洗涤除去未结合的NPAOZ后，加入酶反应底物和生色剂到孔中并且孵育，结合的酶标记

49、物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处测量(选择参比波长600nm)，吸光度与样品中的AOZ浓度成反比。其分析方法：方法检测限和定量检测限。根据试剂空白A450值由校准曲线求出相应浓度，以其3倍标准偏差和10倍标准偏差乘以前处理稀释倍数2分别作为检测限(LOD)和定量检测限(LOQ)，得到相应的试剂空白对应的浓度，标准偏差SD；检测限(LOD)；定量检测限(LOQ)；方法回收率和精密度。添加实验是在阴性样品中加入AOZ标准溶液后按样品前处理和样品分析进行平行实验。得到平均回收率和变异系数RSD；方法重现性。测定了不同批次(n=5)测试时添加实验的

50、变异系数。不同的添加水平，得. . . . - 14 - / 62到相应的平均回收率和变异系数RSD；交叉反应。另外几种硝基呋喃类药物呋喃他酮(AMOZ)、呋喃妥因(AHD)和硝基呋喃腙(SEM)的药代动力学与呋喃唑酮相似，共同的亚糠基主链代很快，而相应的侧链AMOZ、AHD和SEM结构差异较大，其2-NBA衍生物与NPAOZ相比，其IC50均大于0.5mg/L，即以NPAOZ为基准抗原，它们的交叉反应率均低于0.1%，表明此NPAOZ的蛋白抗体特异性良好30。在所有恒温孵育过程中，应避免光线照射，用试剂盒中提供的盖板盖住微孔板。对检测量大、条件较好的实验室，可用全自动酶标仪进行检测，上述操作

51、中的加样、孵育、洗板、发色、终止、测量、计算等步骤可全部由全自动酶标仪来完成。对没有全自动酶标仪的实验室而言，结果计算时也可用由试剂盒供应商提供的数据处理软件经电脑进行处理。由于硝基呋喃类抗生素代迅速，目前国外报道的免疫分析方法都是针对硝基呋喃类抗生素代物的ELISA方法。2004年，Kevin M.Cooper等30首先制备出了呋喃唑酮代物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)的衍生物的高特异性多克隆抗体，IC50值为0.065g/L，其高灵敏度能够满足当前兽药残留分析标准，为呋喃唑酮代物的免疫分析方法奠定了基础。随后，K.M.Cooper等30又建立了虾组织中呋喃唑酮组织结合代物3-氨基-2-恶

52、唑烷酮(AOZ)的酶联免疫分析方法(ELISA)。通过分析20个样品，计算方法检测限为0.1g/kg，使用阴性虾样品添加浓度0.7g/kg，批和批间相对标准偏差分别为18.8%和38.2%。IvaDiblikova等31又制备出呋喃唑酮代物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)的衍生物的高特异性单克隆抗体并建立了直接竞争ELISA方法，其CC值为0.4g/kg，与已建立的确证性的LC-MS/MS方法的0.3g/kg的CC值接近。方法同LC-MS/MS方法的相关性很好，r0.99。目前已有呋喃唑酮、呋喃它酮代物商品化的试剂盒开发出来，而我国只能靠引进国外的试剂盒，现在各商检部门所使用的和各生化试剂公司

53、出售的都是德国r-Biopharm公司生产的试剂盒，其价格昂贵。1.4.4 总结从以上对硝基呋喃类抗生素与其代物的检测方法进行的综述中可以看出，国外对硝基呋喃类抗生素与其代物的检测大都利用色谱方法与其联用技术，另. . . . - 15 - / 62外还有免疫检测方法和分光光度法等方法。高效液相色谱(HPLC)方法的优点是自动化、精确度高、假阳性率低，缺点是仪器昂贵、操作繁琐、样品处理复杂、成本高、废弃试剂易造成环境污染、需要专业分析人员。各种联用技术如LC-MS、LC-MS/MS提高了分析的灵敏度、精确度，降低了检测限，假阳性率更低，特异性更强，在药物残留分析中应用发展迅速且前景广阔，但同时

54、也存在同HPLC方法一样的缺点。ELISA方法具有快速、简便、灵敏、方法种类多、高特异性等优点，缺点是容易出现假阳性问题。分光光度法虽然操作简单，但测定结果准确度不高，灵敏度低，不能作为确证性方法。从选择性、准确性、灵敏性、稳定性、操作难易与费用等方面综合考虑，酶联免疫分析法(ELISA)是比较好的残留检测方法，但不能作为确证方法。高效液相色谱法以与各种联用技术是硝基呋喃类抗生素与其代物的最终确证性的检测方法。我国加入WTO以后，加大了同欧盟、美国、日本等发达国家的贸易往来，促进了我国经济的发展，但同时发达国家对我国推行的“绿色壁垒”“技术壁垒”问题也严重冲击着我国对外出口贸易。发达国家对进口

55、到他们国家的食品要求检测的残留药物的数目越来越多，最高限量也越来越低，我国出口的动物性食品退货的现象越来越多而造成很大损失。近几年欧盟、美国、日本等发达国家对从我国进口的动物源性食品都要求严格检测硝基呋喃类药物与其代物。根据欧盟2004/621/EC决议，输欧的蜂蜜和蜂王浆、养殖水产品、剥壳和/或加工虾、小龙虾、肠衣、兔肉必须出具相应的化学残留检测证明。附加证明的主要容是：该产品出口前经过兽药残留特别是氯霉素和硝基呋喃代物的检测，检测结果要符合以下要求:氯霉素0.3g/kg；呋喃唑酮(AOZ)1.0g/kg；呋喃它酮(AMOZ)1.0g/kg；呋喃妥因(AH)1.0g/kg；呋喃西林(SC)2

56、91，340296；209166，212168；249134，252134；236134，240134定量。. . . . - 39 - / 62图 3-7 衍生化后的硝基呋喃代物断裂方式3.8 标准曲线图谱与线性围3.8.1 标准曲线图谱硝基呋喃类代物的标准曲线图谱如下：图3-8 呋喃妥因标准曲线图谱. . . . - 40 - / 62图3-9 呋喃它酮标准曲线图谱图3-10 呋喃唑酮标准曲线图谱. . . . - 41 - / 62图3-11 呋喃西林标准曲线图谱该加入标准混合溶液的标准曲线的编制基于五个浓度水平，向动物组织与水产品中加入的浓度如下：0.5，1.0，1.5，3.0 和 6

57、.0g/。将混合标物（AOZ-d4 和 AMOZ-d5）加入到全部样品中。AOZ-d4 用来测定 AHD，AOZ 和SEM，而 AMOZ-d5 是用来测定 AMOZ 的。根据标准曲线，用分析物与內标物峰面积的比值来确定目标物的含量的，然后用分析软件进行数据计算。3.8.2 线性围根据计算得到其相应的回归方程和相关系数如下：AHD：y=0.1065x+0.1204，r=0.998AOZ：y=0.1392x+0.04139，r=0.996AMOZ：y=0.1129x+0.04419，r=0.999SEM：y=0.1286x+0.09800，r=0.993由4种硝基呋喃类代物的回归方程与相关系数表明

58、，4种硝基呋喃类代物在0.56.0g/浓度围线性关系良好。. . . . - 42 - / 623.9 质量控制与注意事项3.9.1 质量控制每组实验，需同时进行溶剂空白实验、阴性控制样品实验和阳性控制样品实验。（1）溶剂空白不加试样，用与样品一样的方法进行处理。（2）阴性控制样品阴性控制样所用动物由本实验室动物房自行饲养或经确证为阴性的样品。称取3.00.05g阴性控制样品，置于50mL棕色离心管中，用与样品一样的方法进行处理。（3）阳性控制样品称取3.00.05g阴性控制样品，置于50mL棕色离心管中，用移液枪加入100ng/mL的混合标准工作液30L（相当于每kg样品中含有1.0g目标化

59、合物），用与样品一样的方法进行处理。按标准工作曲线法或外标法进行定量，计算回收率，用来判断本组操作的可靠性。（4）可接受检验结果样品检验时质量控制实验的回收率数值应落在精密度实验的3倍标准偏差以。3.9.2 注意事项（1）安全提示本标准操作程序中用到易燃有毒化学品，例如甲醇、乙腈、盐酸，应避免吸入其蒸气或直接与皮肤接触，处理此类物质时可在通风橱操作，必要时可佩带防护手套、防护镜或防毒面具（2）方法提要. . . . - 43 - / 62本标准操作程序是根据本实验室科研课题动物组织中硝基呋喃代物代物的多种检测方法、残留规律与控制的系统研究中“HPLC-MS/MS 测定动物组织中硝基呋喃代产物残

60、留量”分析方法，并在对首次发布的动物组织中硝基呋喃代物残留量的测定方法高效液相色谱-串联质谱法标准操作程序进行重新修订后，按我国残留检测质量控制指南的要求，进行周密验证后而建立的。本操作程序适用于检测动物组织和水产品中硝基呋喃代物：呋喃他酮代物（AMOZ）、呋喃西林代物（SEM）、呋喃妥因代物（AHD）、呋喃唑酮代物（AOZ）。（3）应当进行重复测定的情况仪器状态不稳，如：标准离子流图变形，真空状态不稳定，色谱柱操作压力过载等以与其他被分析人员判定为不正常的情况。当怀疑有高浓度标准溶液在色谱柱上残留时，应当采取措施清洗色谱柱并防止再次出现残留。有明显证据标明目标化合物的存在，但是有很强的外源性