蛋白质分离纯化与层析技术进展

1、蛋白质分离纯化与层析技术进展鲍时翔􀀁 姚汝华( 华南理工大学生物工程系)摘􀀁 要􀀁 􀀁 蛋白质分离纯化是蛋白质产品工业化生产的关键之一。文中分析了蛋白质分离纯化的特点, 指出了分离纯化蛋白质应解决的一些问题。层析技术是一种有效的蛋白质纯化方法, 文中从层析方法、层析固定相、层析过程的数学模拟三方面评述了层析技术的新进展。关键词􀀁 蛋白质; 纯化; 层析; 分离中图资料分类号􀀁 TQ 201􀀁21; O658􀀁1近20 年来, 生物技术的发展非常迅速。运

2、用基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术, 已能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。和其它生物产品的生产过程一样, 蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。上、中游过程是运用生物技术生产目标产物, 下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物。目前, 生产蛋白质的上、中游技术如基因突变、基因重组与表达、基因工程菌的大规模培养等技术发展很快, 而下游蛋白质分离纯化技术却没有得到相应发展。很多蛋白质在实验室规模已生产成功, 但却无法走向工业化生产而取得经济效益和社会效益 1 。因此, 急需发展蛋白质分离纯化技术。1 􀀁 蛋白质分离纯化的特点和需要解决

3、的问题1􀀁1 􀀁 蛋白质分离纯化的特点1) 大多数蛋白质产品是生物活性物质, 在分离纯化过程中, 有机溶剂、溶液pH 值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活。2) 蛋白质产品在物料中含量很低, 且物料组成非常复杂。例如, 利用基因工程菌发酵生产蛋白质, 物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等, 目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1%。有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体, 为获取蛋白质, 还需进行细胞破碎, 结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。3) 含蛋白质产品的物料不稳定, 蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。4) 很多蛋白质产品作

4、为医药、食品被人类利用, 因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的,产品无菌、无致热源等。1􀀁2 􀀁 实现蛋白质产品的分离纯化应解决的问题1) 设计蛋白质产品分离纯化的最佳工艺, 用最少的分离步骤获得最大的产率, 同时确保来稿日期: 1996􀀂01􀀂18鲍时翔, 男, 1966 年生, 博士后; 主要研究方向: 蛋白质纯化工程, 发酵工程。华南理工大学生物工程系, 邮编: 510641蛋白质产品的纯度。2) 发展蛋白质纯度的快速分析检测技术。在下游的各道工序, 准确、快速地对蛋白质产品进行纯度分析和活性检测, 以保证产品的质量。

5、3) 搞好上、中、下游技术的配合, 便于蛋白质产品的分离纯化。大多数蛋白质产品的分离纯化, 需消耗大量的人力、物力, 因此应尽可能改进上、中游技术, 减少下游过程负荷。例如, 利用金黄色葡萄球菌, 发酵生产A 蛋白。通常, A 蛋白结合于菌体胞壁上, 需要进行细胞破碎,然后将A 蛋白从胞壁上剪切下来, 过程繁琐, 难度大。若运用生物技术培养出A 蛋白分泌型菌来生产,A 蛋白的分离纯化就容易得多。2 􀀁 层析技术在蛋白质分离纯化中的地位􀀁 􀀁 分离纯化蛋白质的方法很多 2 , 对于不同的目标产物, 分离纯化方法不同。选择合适的工艺路线, 取决

6、于目标产物的理化、生物特性。例如, 目标产物和杂质的密度不一样, 可采用离心技术加以分离; 目标产物和杂质在一定的溶液环境中溶解度不同, 可采用沉淀技术加以分离; 目标产物和杂质在亲水性高分子两相溶液中分配不同, 可采用双水相萃取技术加以分离;若目标产物和杂质等电点不同, 可采用离子交换层析和电泳技术分离。通常, 为获得高纯度目标产物, 往往需要综合利用目标产物的理化特性, 采用多种分离技术组合, 但分离步骤多, 分离时间长, 则影响目标产物的得率和回收。在众多的蛋白质分离纯化技术中, 层析是一门关键的技术, 它通常在分离工序的后部, 决定着产品的纯度和收率。和其它分离技术相比, 层析技术具有

7、以下特点: 1) 分离效率高。离心、沉淀、双水相萃取技术往往只能获取粗产品, 而运用层析技术, 可得到纯度较高的生物产品。例如, 在中空纤维膜反应器内培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体, 单克隆抗体存在于杂交瘤细胞培养液中。采用沉淀分离技术只能获得粗产品, 为提高单克隆抗体纯度, 还必须结合离子交换层析、分子筛层析等 3。若运用亲和层析技术, 以A 蛋白为配基, 从杂交瘤细胞培养上清液中, 经一步纯化, 得到的单克隆抗体纯度可达到电泳纯 4; 2) 和电泳分离相比, 层析过程易于放大, 易于自动化。若采用电泳技术分离蛋白质, 虽然产品纯度非常高, 但其过程却产生大量的热, 不但有损于蛋白质的生物活性, 而且过程难于放大。层析过程并不产生明显的热量,放大可采用加大柱径和高度的方法。运用计算机进行控制, 还可实现操作过程的自动化 5, 6 ;3) 层析技术适用性广。差不多每一种蛋白质纯化过程都包括层析技术, 或者是离子交换层析, 或者是分子筛层析, 或者是几种层析技术的组合。针对蛋白质不同的生物特性, 采用不同的层析技术, 可获得纯度很高的蛋白质产品。在蛋白质分离纯化方法中, 层析技术占有重要地位。当