关于人鼠嵌合抗体制备的可行性

1、-关于人 - 鼠嵌合抗体制备的可行性一、概述人 -鼠嵌合抗体，即抗体的可变区来自鼠单克隆抗体，而恒定区则来自人的抗体。它是通过从杂交瘤细胞分离出功能性可变与I恒定区基因连接，插入适当表达载体，区基因，人g转染宿主细胞表达产嵌合抗体既保留了亲本抗体特异性结合抗原又大大减少了生。的能力，鼠源性在人体内的免疫原性，其半衰期明显延长，且在介导CDC 及 ADCC 方面亦明显增强。二、市场分析附表是中国SFDA 批准上市和进入临床的治疗型单抗药物-抗体名称Muromonab-CD3RituximabTrastuzumabBasiliximabTrastuzumabOKT3抗人 IL-8 单克隆抗体乳膏重

2、组人源化抗人表皮因子受体单克隆抗体注射液碘 131I 美妥昔单抗注射碘 131I 人鼠嵌合型肿瘤细胞核单克隆抗体注射液重组人型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白鼠抗人 T 淋巴细胞 CD3表面抗原单克隆抗体注射用抗肾病综合症出血热病毒单克隆抗体（ I型）抗人肝癌单抗Hepama 1抗乙型脑炎单抗注射用重组人型肿瘤坏死因子受体 -抗体融合厂家靶抗原强生CD-3罗氏CD-20罗氏HER-2诺华CD-25基因泰克HER-2武汉生物制品研CD-3究所东莞宏远逸士生IL-8物公司百泰生物药业人表皮因公子司受体成都华神集团， 第四军医大学上海美恩生物技术公司上海中信国健肿瘤坏死药因业公司子济南天康生物制CD-3

3、品公司武汉生物制品所，第四军医大学中科院细胞所北京生物制品所，第四军医大学上海美恩生物公司抗体类适应症研发型阶段鼠源抗移植排斥批准上市嵌合B 细胞非霍奇金批准上市淋巴瘤人源化乳腺癌批准上市嵌合抗移植排斥批准上市人源化乳腺癌批准上市鼠源抗移植排斥批准上市鼠源银屑病批准上市批准人源化上皮源性肿瘤上市批准鼠源肝癌上市嵌合抗肿瘤批准上市人源化银屑病和 强直性批准上市脊柱炎鼠源抗移植排斥临床研究临床鼠源出血热期鼠源肝癌临床研究鼠源乙型脑炎临床研究临床嵌合肿瘤研究-蛋白-目前国内上市的单抗药物有11 个，其中5 个是国外进口产品，我国上市的自行开发的治疗性单抗药物6 个，处于临床研究阶5 个 6) 。其中

4、，武汉生物制品研究所的有段的有(表抗肾移植单OKT3 （注射用鼠源性T 淋巴细CD 抗原单克隆抗体） ，也是最早批准抗抗人胞3上市的国内自行研制的具有免疫抑制作用，可逆转对移植器官的由北京百抗体，排斥反应；泰生物药业有限公司与古巴合作开发的I 类癌症治疗新药“重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体”（商品名：泰欣生）于2005 年 4 月 11 日获得国家I类新药证书。这是我国批准的第一个人源化单克隆抗体药物，它的问世标志着我国在癌症靶向治疗和人源化抗体药物领域取得重大突破，该药主要用于治疗头颈部、食管、肺部、乳腺、结直肠等部位的上皮源性肿瘤；由第四军医大学、成都华神集团股份有限公司联合研制

5、的碘131美妥昔单抗注射液（商品名：利卡汀），于 2005 年 4 月 20 日获得国家I类新药证书。这是全球第一个用于治疗原发性肝癌的药物，也是我国第一个具有自主知识产权的抗体类药物。三、应用嵌合抗体目前主要用于药物治疗方面，与鼠抗相比， 嵌合抗体既保留了鼠源可变的高亲和性，又具有人Fc 段的多种免疫杀伤功能，从而大大降低了人抗鼠抗体反应的发生几率，改善了临床治疗效与其它小分子基因工程抗体嵌合抗体作为完成的抗体在果，相比，分子，体内半寿期更长，并具Fc 段的多种免疫杀伤功能。有人四、技术路线-从杂交瘤细胞中提取总RNA反转录合成cDNA扩增轻链、重链的V 区基因克隆、测序分析插入含信号肽及人

6、Ig 重链、轻链 C 区基因的真核表达载体酶切鉴定、测序分析转染 Sp2/0 细胞检测抗体特异性与人源性制备腹水生产抗体五、材料与仪器1 材料大肠杆菌DH5 ，大肠杆菌感受态细胞，T-A 克隆载体T-Easy Vector，含信号肽及重链、轻链恒定区基因的质粒pAc- -CH3 ，分泌单抗的杂交瘤细胞，真核表达载体pcDNA3.1，小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0 。2 主要试剂氨苄西林钠，限制性内切酶，T4 DNA连接酶，Taq DNA 酶， Trizol RNA 提取试剂盒，反转录PCR 试剂盒，琼脂糖，嗅化乙锭(EB) ，dNTPs，DNA Marker，DNA凝胶回收试剂盒，质粒抽提试剂盒，胎

7、牛血清，无血清培养液，二甲亚砜(DMSO) ，转染试剂盒 LipofectamineTM2000 ， MTX ，抗原，羊抗人IgG Fc 片段 -HRP 酶标抗体。3 主要仪器低温高速台式离心机，恒温摇床，恒温水浴箱，水平式电泳仪，PCR 扩增仪，紫-外分光光度计，紫外透射仪，CO 2 培养箱，倒置显微镜，洁净工作台，酶标仪。六、关键技术与方法1 可变区基因克隆1.1RNA 提取及反转录取对数生长期的杂交瘤细胞株约10 7 个细胞，按照 Trizol RNA 提取试剂盒的说明书抽提细胞的总RNA ，再进行RT-PCR 扩增，回收纯化扩增产物备用。1.2扩增轻链、重链的V 区基因根据 Orlan

8、di等（ 1989 ）设计的扩增小鼠可变区基因的引物，以上述扩增产物为模板扩增抗体基因的可变区。回VH360 bp ）、 VL330 bp ）片段，插收重链（约轻链（约入 T-载体，各3 份样品测序。测序所得GeneB核酸数据库中进行分easy送序列在ank类及同源性分析。两端加入酶切位点根据上述PCR 产物序列设计含酶切位点的引物，再次进行扩增，以使抗体可变区基因片段具有与载体相吻合的酶切位点，便于插入表达载体。回收纯化扩增产物备用。2 嵌合抗体表达载体构建改造含信号肽及人Ig 重链和轻链 C 区基因片段的单克隆位点设计含重链信号肽起始位点序列及酶Nhe 的上游HLF，切位点引物（ KOZA

9、K+4G即 GCCGCC ATG G），位点的下游HLR ，以质pAc-为模板，和含Xh引物粒CH3o扩增出重链信号肽基因片段；Xh Kp位点上游HCF ，和 Furin设计含o和n引物含（ RKRR ）序列及酶切Xb的下游引HCR ，以pAc-为模板，扩增位点a物质粒CH3出重链恒定区基因片段片Xh 连接上述片段得到含重链信MC 及重链段；用o号肽、S恒定区的基因片段。设计含酶切Apa的上游LLF ，和EcoR 位点的下游LLR ，以质位点引物含引物粒 pAc- -为模板，扩增出轻链信号肽基因片段；EcoR Hin 位点上CH3设计含和d游引LCF ，和 Pme 的下游LCR ，以pAc-

10、为模板，扩增出轻链恒物含引物质粒CH3-定区基因片段片段；EcoR 连接上述片段得到含轻链信MC 及轻链恒定区的用号肽、S基因片段。构建含信号肽及人Ig 重链和轻链 C 区基因片段表达空载体用合成的含酶切位点（Xba 和 Apa ）的 2A 序列连接上述重、轻链，得到含信-号肽及人Ig 重链和轻链C 区基因的基因片段LigC （Leader + IgConstant）。然后与Nhe和 Pme 双酶切过的pcDNA3.1-CA大片段连接，即得到嵌合抗体真核双表达载体pcDNA3.1-CA（ chimeric antibody, CA）。pcDNA3.1图谱插入含鼠源Ig 重链和轻链V 区基因双酶

11、切表达载体pcDNA3.1-CA和纯化的VL ，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段后 ,连接、转化大肠杆菌，筛选出pcDNA3.1-CA-VL阳性克隆，富集培养后提取质粒进行酶切鉴定。然后， 双酶切表达载体pcDNA3.1-CA-VL和纯化的VH ，分离纯化相应的酶切片段，重复上述步骤，构建成重组表达载体pcDNA3.1-CA-XX （抗原单词的首字母）。3 转染 Sp2/0 细胞-接种适量 Sp2/0 细胞于培养瓶中， 培养 12 h 后用纯化的载体 pcDNA3.1-CA-XX DNA,采用 Lipofectamine 2000 试剂转染，按试剂盒使用说明书进行。设置空载体和无载体的-细胞为

12、对照。 转染 72 h 后，加含 MTX 的选择性培养基进行筛选。2 周后将生长出的阳性克隆利用有限稀释法单克隆化。4 阳性克隆鉴定与筛选以间接法用抗原和酶标羊抗人IgG Fc 片段抗体检测嵌合抗体的特异性及重组性。以适量抗原包被酶标板，加细胞培养上清反应后，再加羊抗人IgG Fc 片段 -HRP 酶标抗体（经鼠Ig 吸附过）孵育，显色后测A490 吸光值。5 抗体腹水生产腹腔种植转染瘤细胞，57 天后抽取腹水。一只种植杂交瘤细胞的小鼠有时可产生多达 10ml 的腹水。报道称从腹水中获得的嵌合抗体产量可达12 mg/ml。七、时间及成本预算表 1时间预算项目时间（周）载体构建（外包，一次性）8杂交瘤细胞培养0.5RNA 提取与反转录0.5引物合成1V 区基因扩增与克隆2V 区基因测序1插入表达载体及鉴定2表达载体扩增与抽提1转染 Sp2/0 细胞与筛选3嵌合抗体检测与筛选1总计（ First Time ）20表 2 成本预算项目费用（元）感受态细胞-T-Easy Vector载体构建（外包）T4