分子生物学-8真核生物基因表达调控

1、真核生物基因真核生物基因的表达调控的表达调控主要内容主要内容n概述概述n染色体水平上的调控染色体水平上的调控n染色质水平上的调控染色质水平上的调控nDNADNA水平上的调控水平上的调控n真核细胞真核细胞类基因的调控区类基因的调控区n真核细胞真核细胞类基因的转录调控因子类基因的转录调控因子一、概述一、概述DNAhnRNAmRNA蛋白质前体蛋白质前体活性蛋白质活性蛋白质mRNA降解物降解物核核细胞质细胞质染色体、染色质、染色体、染色质、水平上的调控水平上的调控转录调控转录调控转录后加工调控转录后加工调控转运调控转运调控翻译调控翻译调控mRNA降解的调控降解的调控翻译后加工翻译后加工的调控的调控（一

2、）真核生物（一）真核生物基因表达多层次性基因表达多层次性（二）真核生物基因表达调控的种类（二）真核生物基因表达调控的种类涉及基因的迅速打开和关闭，刺激涉及基因的迅速打开和关闭，刺激信号主要是信号主要是激素激素和和生长因子生长因子短期调控短期调控或或可逆性调控可逆性调控：长期调控长期调控或或不可逆性调控不可逆性调控：基因基因永久性永久性或或半永久性半永久性地开启和地开启和关闭，不可逆地改变细胞生化特关闭，不可逆地改变细胞生化特征，征，最终导致细胞分化最终导致细胞分化二、染色体水平上的调控二、染色体水平上的调控（一）基因丢失（一）基因丢失Definition: 在细胞分化过程中，通过在细胞分化过程

3、中，通过丢失掉某些基因而去除这些基因的活性。丢失掉某些基因而去除这些基因的活性。（二）基因扩增（二）基因扩增Definition: （amplification of gene）指基因组中特定基因指基因组中特定基因的拷贝数专一性大量增加的现象。的拷贝数专一性大量增加的现象。n典型例子是典型例子是免疫球蛋白免疫球蛋白基因的表达基因的表达（三（三）染色体重排染色体重排(chromosome rearrangement)轻链轻链k基因的重排基因的重排三、染色质水平上的调控三、染色质水平上的调控（一（一）染色质的结构染色质的结构DNA组蛋白组蛋白核小体核小体染色质染色质 组蛋白是组蛋白是富含精氨酸和赖

4、氨酸的碱性蛋白富含精氨酸和赖氨酸的碱性蛋白，有有H1、H2A、H2B、H3和和H4共共5种。种。染色质折叠的放射环模型染色质折叠的放射环模型核小体颗粒的晶体结构核小体颗粒的晶体结构 H1的直接功能是阻的直接功能是阻止核小体的移动，阻碍止核小体的移动，阻碍DNA序列进一步暴露。序列进一步暴露。 除去除去H1会活化部分会活化部分转录活性，是染色质活转录活性，是染色质活化的重要事件化的重要事件n由组蛋白和由组蛋白和DNA组成的染色质结构限制了转组成的染色质结构限制了转录因子对录因子对DNA的接近与结合，实际上的接近与结合，实际上起着阻起着阻遏转录的作用遏转录的作用。n基因转录需要染色质发生一系列重要

5、的变化，基因转录需要染色质发生一系列重要的变化，如染色质去凝集，核小体变成开放式的疏松如染色质去凝集，核小体变成开放式的疏松结构，使转录因子等更容易接近并结合核小结构，使转录因子等更容易接近并结合核小体体DNA。n有两种方式可以显著改变有两种方式可以显著改变DNA的易接近性：的易接近性：组蛋白的乙酰化组蛋白的乙酰化和和核小体重塑核小体重塑。（二（二）染色质的染色质的3种状态种状态阻遏状态阻遏状态活性状态活性状态激活状态激活状态（三（三）异染色质化异染色质化常染色质常染色质（euchromatin）异染色质异染色质（heterochromatin）组成型异染色质组成型异染色质兼性异染色质兼性异染

6、色质着丝粒、端粒、核仁形成区着丝粒、端粒、核仁形成区补充：补充：lyon假说假说Definition: 巴氏小体巴氏小体（Barr body）：）：正常正常雌性雌性哺乳动物哺乳动物的核中有一个的核中有一个高度凝聚的染色质团高度凝聚的染色质团，它是一个失活的它是一个失活的X染色体。染色体。Definition: 指在指在XY性别决定性别决定机制的生物中，机制的生物中，使使性连锁基因性连锁基因在两种性别中有相等在两种性别中有相等或近乎相等的有效剂量的遗传效应。或近乎相等的有效剂量的遗传效应。剂量补偿效应剂量补偿效应(dosage compensation effect)n正常雌性哺乳动物的体细胞中

7、，正常雌性哺乳动物的体细胞中，两条两条X染色体中染色体中只有一条在遗传上只有一条在遗传上有活性的有活性的，另一条无活性。，另一条无活性。n失活是随机的。失活是随机的。Mary.F.Lyon(1925-)lyon假说假说n失活发生在胚胎发育的早期失活发生在胚胎发育的早期n杂合体雌性在伴性基因的作杂合体雌性在伴性基因的作用上是嵌合体。用上是嵌合体。Example:玳瑁猫玳瑁猫（四（四）组蛋白的修饰组蛋白的修饰（ Histone modification ）n每种核心组蛋白包括一每种核心组蛋白包括一个个80个氨基酸残基构个氨基酸残基构成的保守的区域称为成的保守的区域称为组组蛋白折叠域蛋白折叠域（hi

8、stone fold domain）和一个突和一个突出于核小体核心之外、出于核小体核心之外、由由20个氨基酸残基组成个氨基酸残基组成的的N端尾端尾。nN端尾端尾的相互作用对核的相互作用对核小体的聚集和染色质折小体的聚集和染色质折叠非常重要，也是叠非常重要，也是组蛋组蛋白的主要修饰部位白的主要修饰部位。核心组蛋白的修饰核心组蛋白的修饰乙酰化乙酰化(acetylation)甲基化甲基化(methylation)磷酸化磷酸化(phosphorylation)乙酰化是最早发现与转录有关的组蛋白修饰方式乙酰化是最早发现与转录有关的组蛋白修饰方式组蛋白修饰与基因活性的关系组蛋白修饰与基因活性的关系n在在含

9、有活含有活性基因的性基因的染染色色体体结构结构域域中，中，组组蛋白蛋白乙酰乙酰化化程度程度增加增加，组蛋白甲基化程度减少组蛋白甲基化程度减少1.1.核心组蛋白的修饰核心组蛋白的修饰Acetylation occurs in two different circumstancesnduring DNA replication;nwhen genes are activatedduring DNA replicationDNA复制时，同时要合成复制时，同时要合成新的组蛋白。新的组蛋白。在组蛋白组在组蛋白组装成核小体之前被乙酰化装成核小体之前被乙酰化，组装完成后又去乙酰化组装完成后又去乙酰化when

10、 genes are activated组蛋白乙酰化，组蛋白乙酰化，使使基因控制区与核小基因控制区与核小体偶联变得松弛体偶联变得松弛，使染色质变成活性使染色质变成活性状态。状态。n组蛋白乙酰化酶组蛋白乙酰化酶 (Histone acetyltransferase，HATs)n组蛋白去乙酰化酶组蛋白去乙酰化酶 (Histone deacetylase，HDACs)许多组蛋白乙酰化酶是以往鉴定过的许多组蛋白乙酰化酶是以往鉴定过的激活蛋白或辅激活蛋白激活蛋白或辅激活蛋白（coactivator）。）。CBP/p300可乙酰化可乙酰化H4 的的N 端尾端尾，PCAF 可乙酰化可乙酰化H3 的的N端尾端

11、尾去乙酰化与基因活性的阻遏有关去乙酰化与基因活性的阻遏有关 在酵母中，在酵母中，SIN3SIN3和和Rpd3 Rpd3 与与Ume6 Ume6 形成复合物，能阻遏该启形成复合物，能阻遏该启动子转录。动子转录。Rpd3 Rpd3 有组蛋白去乙有组蛋白去乙酰化酶活性酰化酶活性2.H12.H1组蛋白磷酸化组蛋白磷酸化nH1H1组蛋白对核小体起装配作用，确定核小体组蛋白对核小体起装配作用，确定核小体方向性，并将基本的串珠进一步组装到方向性，并将基本的串珠进一步组装到3030nmnm的纤维中。的纤维中。nH1H1组蛋白磷酸化后与组蛋白磷酸化后与DNADNA亲和力下降，造成染亲和力下降，造成染色质疏松，可

12、提高染色质的活性色质疏松，可提高染色质的活性n有丝分裂中有丝分裂中H1H1的磷酸化导致其对的磷酸化导致其对DNADNA的亲和力的亲和力下降，可能与具有转录活性的染色质伸展状下降，可能与具有转录活性的染色质伸展状态相似。态相似。组蛋白修饰与基因活性的关系组蛋白修饰与基因活性的关系n1 1、组蛋白、组蛋白H1H1与染色质结合不紧密；与染色质结合不紧密；n2 2、4 4种核内组蛋白含量虽然正常，但是乙酰种核内组蛋白含量虽然正常，但是乙酰化程度比非活性染色质的高；化程度比非活性染色质的高；n3 3、活性染色质中，组蛋白、活性染色质中，组蛋白H2BH2B很少磷酸化；很少磷酸化；n4 4、核小体结构结合了

13、两种小分子量的非组蛋、核小体结构结合了两种小分子量的非组蛋白白HMG14HMG14和和HMG17HMG17；n5 5、组蛋白组蛋白H3H3的巯基暴露。的巯基暴露。n6.6.处于转录活化的染色质区域，对处于转录活化的染色质区域，对DNaseIDNaseI敏敏感性比无转录活性区高得多感性比无转录活性区高得多活性染色质特征活性染色质特征（五（五）染色质的重塑染色质的重塑（chromation remodeling）Definition: 染色质和单个核小体内染色质和单个核小体内发生的任何可检测到的变化发生的任何可检测到的变化两两种种改改变变染染色色质质结构结构的的模模型型占先模型占先模型(Pre-e

14、mptive model)动力学模型动力学模型(Dynamic model)占先模型占先模型(Pre-emptive model) 如果在启动子部位如果在启动子部位形成了核小体，则转录形成了核小体，则转录因子和聚合酶不能与因子和聚合酶不能与DNA 结合，反之亦然。结合，反之亦然。动力学模型动力学模型(Dynamic model) 在在ATP水解释放能水解释放能量的驱动下，各种转录量的驱动下，各种转录因子将核小体从因子将核小体从DNA中中置换出来。置换出来。n染色质重塑涉及在基因组一个较短的区染色质重塑涉及在基因组一个较短的区域中核小体位置的改变或者结构的改变，域中核小体位置的改变或者结构的改变

15、，是一个能量依赖的过程，由是一个能量依赖的过程，由染色质重塑染色质重塑复合物复合物（chromatin remodeling complex）催化完成。催化完成。染染色色质质重塑复合物重塑复合物nSWI/SNF类复合物有解旋酶活性，在类复合物有解旋酶活性，在ATP作作用下，使核小体用下，使核小体DNA螺旋程度降低，组蛋白螺旋程度降低，组蛋白八聚体沿八聚体沿DNA移动，核小体结构松散。移动，核小体结构松散。染染色色质质重塑复合物的作用机理重塑复合物的作用机理染色质活化过程染色质活化过程（1）转录因子结合于）转录因子结合于特定序列特定序列（2 2）染）染色色质质重塑重塑复合物结合复合物结合（3）转

16、录因子被释放）转录因子被释放转录因子、组蛋白乙酰化酶转录因子、组蛋白乙酰化酶和和染色质重塑复合体染色质重塑复合体的的结合顺序因启动子的不同而不同。结合顺序因启动子的不同而不同。染色质结构重塑染色质结构重塑（4 4）乙酰化酶复合物结合）乙酰化酶复合物结合组蛋白被修饰组蛋白被修饰n（5 5）新的转录因子与）新的转录因子与DNADNA结合。结合。n（6 6）RNARNA聚合酶与聚合酶与DNADNA结合。结合。n（7 7）转录起始需要来自于特异性转录因子经）转录起始需要来自于特异性转录因子经中介复合体传递来的正调控信号。中介复合体传递来的正调控信号。（六（六）活性染色质的活性染色质的DNase敏感性敏

17、感性n处于转录活化的染色质区域，对处于转录活化的染色质区域，对DNaseI敏感敏感性比无转录活性区高得多性比无转录活性区高得多。n是由于此区域染色质结构变得松散，是由于此区域染色质结构变得松散， DNaseI易于接触到易于接触到DNA。n对对DNaseI敏感性只反映该基因具有被转录的敏感性只反映该基因具有被转录的潜能。并不反映该基因一定在转录。潜能。并不反映该基因一定在转录。nDNaseI超敏感位点超敏感位点（ DNaseI HyperSensitive Sites，DHSS)：大多位于基因：大多位于基因5端启动子区域，端启动子区域，少数位于其他部位。少数位于其他部位。n超敏感位点实际上是一段

18、超敏感位点实际上是一段100-200 bp 的的DNA序列特异暴露的区域，可能被一些非组蛋白序列特异暴露的区域，可能被一些非组蛋白结合而抑制了同组蛋白结合，失去了组蛋白结合而抑制了同组蛋白结合，失去了组蛋白的保护。的保护。人类人类-珠蛋白基因簇的超敏感位点珠蛋白基因簇的超敏感位点n5端调控位点，起初级调控作用，它即是一簇端调控位点，起初级调控作用，它即是一簇超敏感位点。超敏感位点。n是染色体是染色体DNA上一种顺式作用元件，结构域上一种顺式作用元件，结构域中含有多种反式作用因子的结合序列，可能中含有多种反式作用因子的结合序列，可能参与蛋白质因子的协同作用，使启动子处于参与蛋白质因子的协同作用，

19、使启动子处于无组蛋白状态。无组蛋白状态。（七（七）染色质的功能区域染色质的功能区域1.基因座控制区基因座控制区(locus control region, LCR)nLCR是一种远距离顺式调控元件是一种远距离顺式调控元件n使使LCR界限之内的基因具有潜在活化的可能界限之内的基因具有潜在活化的可能n是基因簇中每个基因表达所必需的是基因簇中每个基因表达所必需的n人类的人类的珠蛋白基因簇长约珠蛋白基因簇长约60 Kb，含有含有5个个功能基因，它们的排列顺序是功能基因，它们的排列顺序是5 GA3。n其中其中在胚胎早期表达，在胚胎早期表达，G和和A在胎儿时期表在胎儿时期表达，达，和和在成体中表达。在成体

20、中表达。n每个每个珠蛋白基因都有自己的一套调控系统，珠蛋白基因都有自己的一套调控系统，但它们的表达还要受到基因簇上游但它们的表达还要受到基因簇上游12 Kb的的基基因座控制区因座控制区（locus control region, LCR）的的控制。控制。LCR最初是在研究最初是在研究地中海贫血病地中海贫血病的过程中被发现的，的过程中被发现的，地中海贫血是一种由地中海贫血是一种由或或珠蛋白缺陷导致的血液病。珠蛋白缺陷导致的血液病。许多地中海贫血是由珠蛋白基因编码区突变造成的，许多地中海贫血是由珠蛋白基因编码区突变造成的，但是但是也有一些地中海贫血是由于也有一些地中海贫血是由于珠蛋白基因簇上游珠蛋

21、白基因簇上游12 Kb的区域发生大范围缺失，导致了整个基因簇沉默。的区域发生大范围缺失，导致了整个基因簇沉默。因此，因此，LCR具有增强转录的功能。具有增强转录的功能。人类人类珠蛋白基因珠蛋白基因LCR的增强子活性已由实的增强子活性已由实验证明。验证明。将连接或不连接将连接或不连接LCR的人类的人类珠蛋珠蛋白基因分别转化小鼠细胞白基因分别转化小鼠细胞。研究发现，研究发现，如果缺少如果缺少LCR，珠蛋白基因转珠蛋白基因转录水平通常录水平通常不到内源小鼠不到内源小鼠珠蛋白基因的珠蛋白基因的1。若是若是连接上连接上LCR，外源外源珠蛋白基因的表达珠蛋白基因的表达水平水平与小鼠自身的与小鼠自身的珠蛋白

22、基因的表达水平珠蛋白基因的表达水平相当相当。2.核基质结合区核基质结合区（matrtix associated region, MAR）Definition: 染色质染色质通过通过DNA特定序列结合特定序列结合在核基质蛋白质上在核基质蛋白质上，形成环状结构。，形成环状结构。这特定的这特定的DNA序列称为核基质结合区序列称为核基质结合区 n在靠近在靠近MAR位点的地方经常有拓扑异构酶位点的地方经常有拓扑异构酶II的识别位点，意味着每一个巨大的环状的识别位点，意味着每一个巨大的环状DNA的超螺旋程度受到独立的调控。增强子以及的超螺旋程度受到独立的调控。增强子以及其他调控元件也经常靠近其他调控元件也

23、经常靠近MAR位点。位点。n在某些情况下，染色质重塑也是从在某些情况下，染色质重塑也是从MAR位点位点开始的，并且影响整个染色质环。开始的，并且影响整个染色质环。MAR功能功能：限定：限定DNA的环，使环状结构成为的环，使环状结构成为 相对独立的结构功能单位相对独立的结构功能单位Definition: :可以阻止激活或失活效应传向可以阻止激活或失活效应传向相邻的结构功能单位的相邻的结构功能单位的DNA序列序列3.限定子（限定子（delimiter）或绝缘子（或绝缘子（insulator）n绝缘子是一组在真核生物基因组中建立独立绝缘子是一组在真核生物基因组中建立独立的转录活性区的调控元件，它具有

24、两种性质。的转录活性区的调控元件，它具有两种性质。n第一，当绝缘子位于增强子或者沉默子与启第一，当绝缘子位于增强子或者沉默子与启动子之间时可以动子之间时可以阻断增强子或者沉默子对启阻断增强子或者沉默子对启动子的作用动子的作用。n第二，绝缘子可以第二，绝缘子可以使其界定的基因的表达不使其界定的基因的表达不受位置效应的影响受位置效应的影响。绝缘子的功能绝缘子的功能增强子屏蔽的活性增强子屏蔽的活性。在启动子和增强子之间的绝缘。在启动子和增强子之间的绝缘子阻止启动子接受增强子的转录激活影响子阻止启动子接受增强子的转录激活影响阻碍物活性阻碍物活性。在启动子和浓缩、阻碍状态的染色质。在启动子和浓缩、阻碍状

25、态的染色质之间的绝缘子可以阻止启动子受到浓缩染色质（由之间的绝缘子可以阻止启动子受到浓缩染色质（由沉默子诱导）阻抑基因转录的影响沉默子诱导）阻抑基因转录的影响滑动模型滑动模型。当激活蛋白结合到增强子上，刺激信号或激活蛋。当激活蛋白结合到增强子上，刺激信号或激活蛋白本身沿白本身沿DNA滑向启动子。而绝缘子可能与一个或多个蛋白滑向启动子。而绝缘子可能与一个或多个蛋白结合，阻挡滑向启动子的信号。结合，阻挡滑向启动子的信号。环化模型环化模型。两个绝缘子将一个增强子隔离出来。当蛋白质结。两个绝缘子将一个增强子隔离出来。当蛋白质结合到这些绝缘子上后，它们相互作用，将增强子隔离在环形合到这些绝缘子上后，它们

26、相互作用，将增强子隔离在环形结构中，从而不能激活附近启动子的转录。结构中，从而不能激活附近启动子的转录。绝缘子活性机理的两种假说绝缘子活性机理的两种假说果蝇两个串联基因上的绝缘子效应果蝇两个串联基因上的绝缘子效应DNA结构域可能有以下三种位点结构域可能有以下三种位点四、四、DNA水平上的调控水平上的调控（一（一）DNA的甲基化（的甲基化（methylation）甲基化位点主要在甲基化位点主要在CpG序列序列半甲基化半甲基化全甲基化全甲基化nHpaII能切割能切割非甲基化的非甲基化的CCGG序列序列DNA甲基化的检测甲基化的检测nMspI能切割能切割甲基化或非甲基化的甲基化或非甲基化的CCGG序

27、列序列MspIHpaIIMspI酶切酶切HpaII酶切酶切n基因不能表达的组织中呈甲基化状态，基因不能表达的组织中呈甲基化状态，n活性基因低甲基化状态活性基因低甲基化状态DNA甲基化与基因活性甲基化与基因活性DNA甲基化抑制转录机理甲基化抑制转录机理n影响染色质的结构，稳定染色质的失活状态，影响染色质的结构，稳定染色质的失活状态，阻止转录因子的进入，防止其活化。阻止转录因子的进入，防止其活化。nDNA甲基化直接干涉转录因子与启动子内识别甲基化直接干涉转录因子与启动子内识别位点结合；位点结合；n抑制作用通过抑制作用通过甲基化甲基化CpG结合蛋白结合蛋白（methylated CpG bindin

28、g proteins, MeCP）起作用，这种因起作用，这种因子与转录调控因子竞争甲基化子与转录调控因子竞争甲基化DNA结合位点。结合位点。MeCP-1CH3CH3CH3CH3CH3TFRNA polIIMeCP-1可与多个甲基化的可与多个甲基化的CpG位点结合位点结合MeCP-2CH3CH3CH3CH3CH3SIN3HDACTFRNA polIIMeCP-2能结合到能结合到单个甲基化的单个甲基化的CpG 碱基对碱基对上，上，还结合还结合Sin3 阻遏复合体阻遏复合体(含含HDAC活性活性)，CpG岛（岛（ CpG rich islands）富含富含CpG的区段称为的区段称为CpG岛岛n几乎几

29、乎管家基因管家基因都含都含CpG 岛岛n一般位于基因的一般位于基因的5端区域端区域n大多数大多数CpG岛是岛是未甲基化未甲基化的的nCpG岛中的核小体中岛中的核小体中H1 含量低含量低，其它，其它组蛋白组蛋白被广泛乙酰化被广泛乙酰化，并有超敏感位点，并有超敏感位点n未甲基化未甲基化CpG 岛可能说明岛可能说明基因具有潜在活性基因具有潜在活性，五、真核细胞五、真核细胞类基因类基因的调控区的调控区n转录水平的调控主要是通过顺式作用元件与转录水平的调控主要是通过顺式作用元件与反式作用因子相互作用来实现的反式作用因子相互作用来实现的n顺式作用元件顺式作用元件( (ciscis-regulating e

30、lement)-regulating element)启动子、增强子、沉默子、启动子、增强子、沉默子、绝绝缘缘子子、应答元件应答元件启动子启动子调控元件调控元件增强子增强子（enhancer）沉默子沉默子（ silencer）核心启动子核心启动子(core promotor)上游启动子元件上游启动子元件(upstream promotor element, UPE)基本启动子基本启动子(basal promotor)转录起始位点转录起始位点(Inr)（一（一）启动子（启动子（promotor）核心启动子核心启动子(core promotor)TATA-box： TBP的结合位点，决定转录方向、

31、的结合位点，决定转录方向、 起始位点起始位点启动子上游元件启动子上游元件(UPE)CCAAT-box: CTF、C/EBP的结合位点的结合位点GC-box: sp1的结合位点的结合位点 UPE影响转录起始频率，增强转录起始复影响转录起始频率，增强转录起始复合物的组装能力合物的组装能力在酵母中称为在酵母中称为上游激活元件上游激活元件（UAS）（二（二）增强子（增强子（ enhancer ）SV40早期基因调控区的结构早期基因调控区的结构Definition: 指能使与它连锁的基因转录效率指能使与它连锁的基因转录效率明显增加，并且无方向和位置依赖性明显增加，并且无方向和位置依赖性的的DNA序列。序

32、列。n增强效应十分明显增强效应十分明显n增强子增强子与启动子的相对位置不固定与启动子的相对位置不固定, ,可以位于可以位于基因的基因的55端上游、内部或端上游、内部或33端下游序列中端下游序列中 n可以远离基因的可以远离基因的InrInr起作用起作用n能在能在两个方向两个方向上起作用上起作用n一般具有一般具有组织和细胞特异性组织和细胞特异性1.1.增强子的特点增强子的特点r2b基因中的增强子元件是无方向和位置效应的基因中的增强子元件是无方向和位置效应的a.构建突变质粒构建突变质粒：将：将X2-X3区域（包含增强子）切除后区域（包含增强子）切除后通过四种方式重新插到基因中。通过四种方式重新插到基

33、因中。质粒质粒A和和B： X2-X3片段被片段被正向或反向插到原位置正向或反向插到原位置。质粒质粒C和和D： X2-X3片段被片段被正向或反向插到另一个正向或反向插到另一个XbaI酶切位点酶切位点，位于基因上游几百碱基处。位于基因上游几百碱基处。b.结果表明，结果表明，增强子无方向和位置效应增强子无方向和位置效应。2.2.增强子的种类增强子的种类组织和细胞专一性增强子组织和细胞专一性增强子诱导性增强子诱导性增强子只在特定组织和细胞中，特定的转录因子与之只在特定组织和细胞中，特定的转录因子与之结合，才能发挥功能。结合，才能发挥功能。由于调控因子本身活性是诱导性的，造成对增强由于调控因子本身活性是

34、诱导性的，造成对增强子的结合和增强子活性有可诱导性子的结合和增强子活性有可诱导性3.3.增强子的作用机理增强子的作用机理 三种假说三种假说a.拓扑结构的改变。拓扑结构的改变。激活因子与增强子结合，促进激活因子与增强子结合，促进DNA的拓扑结构或形状发生改变，使启动子向通用转的拓扑结构或形状发生改变，使启动子向通用转录因子敞开。录因子敞开。b.滑动滑动。激活因子与增强子结合，沿。激活因子与增强子结合，沿DNA滑动直至启滑动直至启动子，与启动子直接相互作用激活转录。动子，与启动子直接相互作用激活转录。c.环化。环化。激活因子与增强子结合，使增强子与启动子激活因子与增强子结合，使增强子与启动子之间的

35、之间的DNA环化，促进结合蛋白间的互作并激活转录。环化，促进结合蛋白间的互作并激活转录。增强子功能的要点，实质上是增强子功能的要点，实质上是结合于增强子结合于增强子的激活因子的激活因子与与结合于启动子的普遍性转录因结合于启动子的普遍性转录因子之间的子之间的蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用。蛋白质相互作用。n多重增强子能使一个特定基因对各种激多重增强子能使一个特定基因对各种激活因子的不同组合产生应答活因子的不同组合产生应答。这种排布这种排布格局使细胞能对基因在不同组织或不同格局使细胞能对基因在不同组织或不同发育阶段产生精细的调控发育阶段产生精细的调控。4.多个增强子（多个增强子（Multiple E

36、nhancers）的作用的作用金属硫蛋白金属硫蛋白(Metallothionein，MT)基因基因是是单一基因受多种不同机制调控单一基因受多种不同机制调控的例子的例子金属应答元件金属应答元件(MRE)在应答重金属时激活基因转录在应答重金属时激活基因转录GC框框:转录激活因子转录激活因子Sp1的应答元件的应答元件本底水平增强子本底水平增强子(BLE):转录激活因子转录激活因子AP-1的应答元件的应答元件糖皮质激素应答元件糖皮质激素应答元件(GRE):可被可被糖皮质激素和受体组成糖皮质激素和受体组成的激活因子的激活因子激活转录激活转录金属硫蛋白金属硫蛋白是真核细胞中帮助细胞是真核细胞中帮助细胞对付

37、重金属中毒对付重金属中毒的防御性机制的防御性机制海胆海胆Endo16基因的多增强子模块的排布情况基因的多增强子模块的排布情况 激活因子的不同组合，就会在不同细胞中造成激活因子的不同组合，就会在不同细胞中造成基因不同水平的表达基因不同水平的表达大号和中号的彩色椭圆形和长方形表示大号和中号的彩色椭圆形和长方形表示激活因子激活因子；橙色小椭圆形表示橙色小椭圆形表示结构转录因子结构转录因子；增强子成簇排列增强子成簇排列，分别记为，分别记为G,F,E,DC,B和和A；长垂直线代表限定模块的限制性位点；长垂直线代表限定模块的限制性位点；BP为为基本启动子基本启动子。P568海胆海胆Endo16基因中模块基

38、因中模块A的综合功能的综合功能(a)在在早期发育早期发育中中,模块模块A是唯一开启的模块是唯一开启的模块,它通过基本启动子它通过基本启动子(BP)刺激基因转录刺激基因转录.(b)在在中胚层的晚期发育中胚层的晚期发育中中,模块模块A通过通过整合模块整合模块G和和B的作用的作用,共同共同刺刺激转录激转录.(c)在在外胚层的晚期发育外胚层的晚期发育中中,模块模块A通过通过整合模块整合模块F和和E的作用的作用,阻遏基阻遏基因转录因转录.(d)在在成骨间质细胞的晚期发育成骨间质细胞的晚期发育中中,模块模块A整合模块整合模块DC的作用的作用,抑制基抑制基因转录因转录.(e)LiCl处理处理能能逆转逆转来自

39、模块来自模块A外胚层和成骨间质细胞的外胚层和成骨间质细胞的阻遏信号阻遏信号,刺刺激基因转录激基因转录.Definition: 基因的基因的负调控元件负调控元件，当其结合特异，当其结合特异蛋白因子时，蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用对基因转录起阻遏作用。（三（三）沉默子（沉默子（ silencer ）n沉默子是抑制基因转录的顺式元件沉默子是抑制基因转录的顺式元件。能引起。能引起染色质弯曲缠绕，产生类似于异染色质的结染色质弯曲缠绕，产生类似于异染色质的结构构，致使转录因子无法与邻近基因的启动子，致使转录因子无法与邻近基因的启动子相结合，从而使基因处于关闭沉默状态。相结合，从而使基因处于关闭沉默状态

40、。n有时同一有时同一DNA顺式元件既能表现出增强子的顺式元件既能表现出增强子的活性，又能表现出沉默子的活性，这活性，又能表现出沉默子的活性，这完全取完全取决于与之结合的蛋白质的特性决于与之结合的蛋白质的特性。（四（四）应答元件应答元件(Response element)n热激应答元件热激应答元件(heat shock response element，HSE)n金属应答元件金属应答元件(metal response element，MRE)n糖皮质激素应答元件糖皮质激素应答元件(glucor-ticoid response element，GRE)n血清应答元件血清应答元件(serum res

41、ponse element，SRE) 能与某个（类）专一蛋白因子结合，从而控制能与某个（类）专一蛋白因子结合，从而控制基因特异表达的基因特异表达的DNA上游序列上游序列应答元件能被在一些特定情况下表达的调控因子识别应答元件能被在一些特定情况下表达的调控因子识别应答元件的特点：应答元件的特点：n 1. 可以位于启动子或增强子内可以位于启动子或增强子内n 2. 与转录起始点的位置不固定（多在与转录起始点的位置不固定（多在-200以以内内;单个功能充分单个功能充分,但多为多拷贝但多为多拷贝;可位于启动子可位于启动子/增强子内部）增强子内部）.n3. 多基因由同一因子调控（如：热激效应）多基因由同一因

42、子调控（如：热激效应）n4. 同一基因由多种途径调控（如：金属硫蛋同一基因由多种途径调控（如：金属硫蛋白基因）白基因）. n5. 各效应元件不论位置如何都有独立的活化各效应元件不论位置如何都有独立的活化功能功能.热激反应热激反应是是单一因子调控多个基因单一因子调控多个基因的例子的例子n在真核生物中，热激基因有一个保守的共有在真核生物中，热激基因有一个保守的共有序列序列HSE，被转录因子被转录因子HSTF识别。识别。n温度升高时，温度升高时，HSTF的激活使一组热激基因起的激活使一组热激基因起始转录。始转录。HSTF (heat shock transcription factor ):热休克热

43、休克(基因基因)转录因子转录因子 六、真核细胞六、真核细胞类基因类基因的转录调控因子的转录调控因子DNA结合结构域结合结构域(DNA binding domain)转录激活结构域转录激活结构域(Transcription activation domains)自身活性的自身活性的调控结构域调控结构域调控因子的结构特性调控因子的结构特性n螺旋螺旋- -转角转角- -螺旋（螺旋（ Helix-turn-helix，HTH）n锌指结构（锌指结构（zinc finger）n亮氨酸拉链（亮氨酸拉链（leucine zipper）n螺旋螺旋- -环环- -螺旋（螺旋（helix /loop /helix，

44、HLH）（一（一） DNA结合结构域结合结构域（DNA binding domain）螺旋螺旋- -转角转角- -螺旋（螺旋（ Helix-turn-helix，HTH）识别螺旋识别螺旋，与靶序列，与靶序列DNA的大沟结合的大沟结合n是一种常出现在是一种常出现在DNA结结合蛋白合蛋白中的结构基元中的结构基元n长约长约30个个aa，其中，其中4个个氨基酸（氨基酸（Cys或或2个个Cys，2个个His）与）与一个一个Zn原子原子相结合。相结合。n结构结构像手指状像手指状。 锌指结构（锌指结构（zinc finger） Cys2/ Cys2型型Cys2 / His2型型见于见于甾体激素受体甾体激素受

45、体见于见于SP1，TF A等等n含有多个锌指单元，含有多个锌指单元，n如如SP1有有3个，个，TF A有有9个个n形成形成-螺旋而插入螺旋而插入DNA的大沟的大沟Cys2 / His2型型锌指可以形成锌指可以形成-螺旋螺旋而插入而插入DNA的大沟中的大沟中n甾体激素受体甾体激素受体n含两个锌指含两个锌指Cys2 / Cys2型型GlyGlyGlnSer糖皮质激素特异性糖皮质激素特异性 雌激素特异性雌激素特异性亮氨酸拉链（亮氨酸拉链（leucine zipper）nDNA结合蛋白质和其它蛋白结合蛋白质和其它蛋白质中的一种结构基元质中的一种结构基元(motif)。n两个蛋白质的两个蛋白质的-螺旋之

46、间螺旋之间，依靠依靠leu周期性侧链交错相插，周期性侧链交错相插，形成一个稳定的非共价结合形成一个稳定的非共价结合的的拉链结构拉链结构。n可以形成可以形成二聚体二聚体亮氨酸亮氨酸拉链拉链碱性区碱性区C/EBPJunFosGCN4n具有具有DNA结合结合和和形成形成二聚体二聚体的功能；的功能；n可形成两个可形成两个-螺旋，两螺旋，两个螺旋之间由环状结构个螺旋之间由环状结构相连；相连；nDNA结合功能是由一结合功能是由一个较短的个较短的碱性区域碱性区域所决所决定的。定的。 螺旋螺旋- -环环- -螺旋（螺旋（helix /loop /helix，HLH）n转录调控因子（主要是活化因子）的主要功转录

47、调控因子（主要是活化因子）的主要功能是依赖于能是依赖于转录激活结构域转录激活结构域进行蛋白质进行蛋白质-蛋白蛋白质相互作用，质相互作用，控制转录起始复合物的形成和控制转录起始复合物的形成和调控其活性调控其活性。n一般由一般由DNA结合结构域外的结合结构域外的20-100个氨基酸个氨基酸组成组成 （二（二）转录激活结构域转录激活结构域 （Transcription activation domains）1 1酸性结构域酸性结构域(acidic helix domain)n也叫做也叫做“酸斑（酸斑（ acid blobs）”或或“带负电的带负电的长链长链 （negative noodles）”n富

48、含酸性氨基酸富含酸性氨基酸n 存在于许多转录因子的激活结构域中，存在于许多转录因子的激活结构域中， 如：如：yeast Gcn4 and Gal4, 哺乳动物的哺乳动物的糖皮质激素受体糖皮质激素受体的两个激活结构域的两个激活结构域n2富含谷氨酰胺激活结构域富含谷氨酰胺激活结构域(glutamine-rich domain)：n富含谷氨酰胺富含谷氨酰胺n（SP1，OCT1，OCT 2，SRF等）等） n3 3富含脯氨酸激活结构域富含脯氨酸激活结构域(proline-rich domain)n 富含脯氨酸富含脯氨酸 n 有一个能激活转录的连续脯氨酸残基链有一个能激活转录的连续脯氨酸残基链 （AP2

49、、Jun等）等）n配基结合产生的活化配基结合产生的活化 诱导物作为配基，与转录因子结合，使无诱导物作为配基，与转录因子结合，使无活性的转录因子改变结构，迅速作出应答反应。活性的转录因子改变结构，迅速作出应答反应。酵母的酵母的MT基因基因启动子启动子ACE1无活性无活性Cu2+ACE1有活性有活性ACE1（三（三） 转录调控因子自身活性的调控转录调控因子自身活性的调控n蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质相互作用调控转录因子的活性调控转录因子的活性类固醇激素类固醇激素（如（如糖皮质激素）糖皮质激素）n脂溶性的，脂溶性的，n能够穿过细胞膜能够穿过细胞膜与与类固醇激素受类固醇激素受体体（转录因子）（转

50、录因子）相互作用。相互作用。steroidGREInhibitor(HSP90)Glucocorticoid receptorDissociation, dimerizationn在没有类固醇激素时，该受体与在没有类固醇激素时，该受体与抑制蛋白抑制蛋白结结合，游离在细胞质中合，游离在细胞质中.n有类固醇激素时有类固醇激素时, 1.激素结合到受体上，出来。将其从阻抑物中激素结合到受体上，出来。将其从阻抑物中释放释放2.受体受体二聚化二聚化并转移到核中。并转移到核中。3.受体与其特异的受体与其特异的DNA结合序列结合结合序列结合 (应答元应答元件件) ，从而激活靶基因。，从而激活靶基因。n蛋白质的

51、糖基化蛋白质的糖基化，如，如Sp1n磷酸化与去磷酸化磷酸化与去磷酸化调控因子的核内定位调控因子的核内定位与与DNA的结合活性的结合活性调控转录活性调控转录活性GHGH receptorJAKJAKPSTATPSTATTarget geneSTATSTATn细胞因子与受体结合，受细胞因子与受体结合，受体被活化体被活化n受体二聚化受体二聚化，JAK聚集，聚集，受体与受体与JAK在膜上相连在膜上相连n邻近的邻近的JAK之间自我磷酸之间自我磷酸化化，并磷酸化受体中的并磷酸化受体中的Tyrn依靠依靠SH2结构域，结构域，STAT蛋白结合于受体的蛋白结合于受体的 P-TyrnSTAT的特定的特定Tyr也被

52、也被JAK磷酸化磷酸化nSTAT二聚化二聚化nSTAT转移到核内转移到核内，和特，和特定顺式作用元件结合，调定顺式作用元件结合，调节基因转录节基因转录JAK-STAT pathway n1.激活因子的二聚化激活因子的二聚化n2.激活因子的远距离作用激活因子的远距离作用n3.建构性转录因子建构性转录因子n4.中介因子中介因子（四（四）转录激活因子的作用方式转录激活因子的作用方式n结合在结合在DNA上，使上，使DNA调控区的形状调控区的形状发生改变，以致其他蛋白质能够相互发生改变，以致其他蛋白质能够相互作用而促进转录的蛋白质作用而促进转录的蛋白质3.建构性转录因子或结构转录因子建构性转录因子或结构

53、转录因子（architectural transcription factor）人人T细胞受体细胞受体链（链（TCR ）基因的调控区基因的调控区LEF-1是是淋巴组织增强子结合因子淋巴组织增强子结合因子（lymphoid enhancer binding factor）,本身并不能活化本身并不能活化TCR 基因基因的转录，它是的转录，它是通过结合到增强子的小沟内，使通过结合到增强子的小沟内，使DNA弯弯曲约曲约130度而起作用的度而起作用的。人干扰素（人干扰素（IFN） 基因上装配的增强体结构基因上装配的增强体结构n很多转录激活因子需要一类辅激活子的很多转录激活因子需要一类辅激活子的参与才能发

54、挥激活因子的作用。通过辅参与才能发挥激活因子的作用。通过辅激活子使激活因子与转录装置偶联，激激活子使激活因子与转录装置偶联，激活转录。因此又被称为活转录。因此又被称为中介因子中介因子4.中介因子中介因子(mediator)或辅激活因子或辅激活因子（co-activator ）cAMP应答基因应答基因RRCC催化亚基催化亚基调节亚基调节亚基蛋白激酶蛋白激酶A（PKA）ncAMP production1.PKA activated2.PKA translocated into nucleus3.CREB (cAMP response element-binding protein) activat

55、ed4.CREB dimerized and bind to CRE5.Gene expression与与CRE元件偶联的基因被激活的模型元件偶联的基因被激活的模型核受体活化基因的激活模型核受体活化基因的激活模型核受体应答基因核受体应答基因nCBP直接同核受体的激活结构域相互作用直接同核受体的激活结构域相互作用nCBP结合于称为甾体受体辅激活因子（结合于称为甾体受体辅激活因子（SRC）的蛋白质，同时的蛋白质，同时CBP接触基础转录装置接触基础转录装置（五（五） 蛋白质调控因子功能的研究方法蛋白质调控因子功能的研究方法电泳迁移后滞分析电泳迁移后滞分析(electrophoresis )1.蛋白质

56、与蛋白质与DNA的相互作用的相互作用BEMSA原理图原理图DNase足迹实验足迹实验（footprinting assay）共转录分析共转录分析2.转录激活活性的检测转录激活活性的检测构建含有待测构建含有待测转录因子转录因子X编码基因编码基因的表达性质粒的表达性质粒构建含有蛋白构建含有蛋白X结合位结合位点和报告基因点和报告基因的质粒的质粒X结合位点结合位点报告基因报告基因X编码基因编码基因两种质粒两种质粒同时同时转染宿主细胞转染宿主细胞测定报告基测定报告基因表达产物因表达产物蛋白蛋白X报告基因报告基因表达产物表达产物酵母双杂交系统酵母双杂交系统（yeast two-hybrid assay）n研究研究蛋白质相互作用蛋白质相互作用的非常有效的分子生物的非常有效的分子生物学方法学方法n酵母转录因子酵母转录因子Gal4具有两个结构上可分的，具有两个结构上可分的，功能上相对独立的结构域：功能上相对独立的结构域：DNA结合结构域结合结构域（BD）和和转录激