复方鳖甲软肝方防治肺纤维化细胞凋亡的实验研究

1、复方鳖甲软肝方防治肺纤维化细胞凋亡的实验研究         09-09-08 14:51:00     编辑：studa20                          作者：段斐，耿德海，许文杰，唐志远，史建红【摘要】&

2、#160; 目的通过观察细胞凋亡，探讨复方鳖甲软肝方防治肺纤维化的机理和疗效。方法选SD雄性大鼠180只，随机分为假手术组，模型组，阳性药物对照组，复方鳖甲软肝方高、中、低剂量组，共6组，每组30只。博莱霉素常规造模的同时给药，假手术组和模型组每天灌胃生理盐水，其余4组灌药进行防治。各组分别于7，14，28 d随机抽取10只大鼠，8只制成光镜标本，2只麻醉后快速开胸取肺组织，进行电镜标本的制作。免疫组化载玻片用DEPC处理后备用。结果型和型肺泡上皮细胞以及成纤维细胞均有凋亡。bax在肺泡型和型上皮细胞，肺泡巨嗜细胞胞质和胞膜均表达。假手术组和高、中剂量组呈弱阳性表达，模型组强阳性表达。Bcl-

3、2在核膜和线粒体表达，模型组强阳性表达，药物组弱表达。结论复方鳖甲软肝方通过调节细胞凋亡，上调Bax活性，抑制Bcl-2的活性，抑制型上皮细胞凋亡，减少纤维积聚和纤维化形成，对肺纤维化起到防治作用。 【关键词】  复方鳖甲软肝方；凋亡；超微结构Abstract:ObjectiveTo study the preventive and therapeutic effect of compound prescription with turtle shell (CPTS) on rats with IPF (Idiopathic pulmonary interstitial fibros

4、is) caused by Bleomycin A5.Methods180 SD rats were randomly divided into six groups:sham operation group,model group,positive medicine group, high-dosage group, medium-dosage group and low-medium group.After they were given the medicine, ten rats in each group each time were killed respectively on t

5、he 7th,14th and 28th day. 8 of them were made for light microscope specimen. 2 rats were operated to open thorax and get lung tissue speedily. Immunohistochemical glass covers were dealt with DEPC for use.ResultsAT , AT and fibroblast all showed apoptosis, Bax expression in AT ,AT and alveolus macro

6、phage cytoplasm,cytolemma expression was less positive in sham operation group,high CPTS and medium CPTS groups and remarkably positive in model group,which showed CPTS could restrain apoptosis of AT and macrophage.Bcl-2 was expressed in chondriosome and on karyotheca. Expression in model group was

7、less positive and remarkably positive in CPTS groups,which showed CPTS could restrain formation of IPF.ConclusionCPTS has obvious treating effect through reducing fiber piling and restraining forming of fibrosis on rats with IPF caused by Bleomycin A5, CPTS can regulate the alveolar apoptosis by inh

8、ibiting the Bcl-2 expression, enhancing the Bax expression and inhibiting the apoptosis of AT .Key words:Compound prescription with turle shell;  Apoptotic;  Supermicro structure    特发性肺间质纤维化以肺泡上皮细胞凋亡（apoptosis）导致肺泡结构完整性破坏和肺成纤维细胞增生为特征1。早期各种炎症细胞和肺泡细胞分泌炎症因子引起细胞损伤与细胞增殖失控，启动细胞凋亡

9、的途径，引起肺纤维化2。Bcl-2和Bax是一对相互拮抗的基因产物，两者自可形成同二聚体，也可相互作用为异二聚体。Bcl-2和Bax与凋亡调控直接相关：Bax增高促进细胞凋亡；Bcl-2增高抑制细胞凋亡3。两者的平衡状态维持肺组织细胞的正常，保持呼吸功能的稳定。1  器材1.1  药物防治药物：复方鳖甲软肝方(内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司生产的复方中药干粉，600 g/瓶，批号：20020501)，高剂量1.4 g·kg-1·d-1、中剂量0.7 g·kg-1·d-1、低剂量药物为0.35 g·kg-1·d-1

10、，相当于临床日用量（0.1 g·kg-1）的14倍，7倍，3.5倍。    阳性对照药：醋酸强的松0.56 mg·100 g-1·d-1，广东华南制药厂生产，批号011201。    造模药物：注射用盐酸博莱霉素(bleomycin，BLM-A5 )，日本化药株式会社生产，批号X12100。1.2 动物及分组SD大鼠180只，雄性，体重200220 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物级别：SPF/VAF，许可证编号：SCXK2002-0003。饲养于同级动物房，自由饮水。购入后适应性饲养1周，

11、进行实验分组。动物随机分为6组：假手术组；模型组；阳性药物对照组；复方鳖甲软肝方（以下表格中简称鳖甲方组）高、中、低剂量组。每组30只。各组均于7，14，28 d随机抽取10只大鼠采血，同时取肺制成光、电镜标本。1.3 试剂凋亡试剂购于北京中杉金桥生物技术有限公司分装的Sigma公司试剂。SP-9002，ZLI-9017DAB，SC-7480 Mouse anti-Bax， SC-1666  Mouse  anti-PAR4 SC-7382  Mouse anti-BCL-2。1.4 仪器石蜡切片机，莱卡2016、包埋机，KD-BM。低温冰箱MDFU5410(-6

12、0)成都泰盟科技有限公司，数码显微照相机Nikon Coolpi×4500。2 方法2.1  大鼠肺纤维化模型制备用1.5%戊巴比妥钠（0.1 ml·kg-1）腹腔注射麻醉后，将大鼠仰卧固定于手术台上，颈部剪去毛、常规碘酒与酒精消毒，切开颈正中皮肤，逐层分离，暴露气管，然后用一次性1 ml注射器向气管内注入0.3 ml博莱霉素生理盐水溶液（5 ml·kg-1），然后立即将动物直立并旋转，使药液在肺内均匀分布。假手术组大鼠肺部注入等体积的生理盐水。2.2  取材和切片制备2.3  免疫组化操作步骤（Bcl-2，Bax）将切片置于二甲苯、

13、各脱蜡15 min100%酒精15 min，100%酒精15 min，95%酒精10  min90%酒精10 min，80%酒精5 min，70%酒精5 min，蒸馏水冲洗0.3%甲醇-过氧化氢室温下孵育20 min蒸馏水洗两次，2 min/次 ，PBS洗5 min0.1mol/L枸橼酸缓冲液内微波炉抗原修复（温度98100）20 min室温自然冷却后加10%山羊血清，37湿盒内室温孵育30 min倾去血清，不洗，加一抗，鼠抗PARP(1100),鼠抗Bax和Bcl-2（1100），湿盒内4过夜。取出湿盒室温放置30 min，37放置1 h0.01 mol/L  PBS洗3次，5 min/次湿盒内滴加生物素化二抗（抗鼠1100）0.01mol/L  PBS洗3次，5 min/次滴加辣根酶标记的链酶卵白素工作液，湿盒内37孵育30 min0.01 mol/L  PBS洗3次，5 min/次DAB显色（1 ml蒸馏水中加入DAB、缓冲液及H2O2各一滴，混匀），显微镜下控制显色