小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结

1、小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结 2009-08-19 18:39:07 来源:未知【大中小】评论: 条 摘要:小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛 小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后,实施断颈法处死小鼠。2、用70%乙醇擦拭腹部,把皮肤向后拉,暴露出腹膜。用消毒过的工具,剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开,分离后切除内脏(所有深色的东西。将胚胎转移到(有盖培

2、养皿中,用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎,当你剪的很累以致于不能再剪的时候,加入2ml 胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA,并在37孵育大约20分钟。此时,返回至第一步,对下一只鼠进行操作。6、执行1-4步,到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎,直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化,将皿中的物质转移至50ml锥形管中。9、混匀管内的物质,加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。10、将这些培养瓶放

3、在培养箱中37培养过夜。11、将胚胎置于PBS中,并重复第5步。12、第二天更换培养基,以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时,是冻存细胞的最佳时期。一般说来,这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生,所以请注意观察你的培养瓶。注释:我们已用CF-1品系的鼠制备了成纤维细胞。培养基成分:88%DMEM10%FBS1%NEAA1% 双抗对于新建立的细胞系,要对样本进行支原体检测。小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代1、移去MEF培养基2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞(以去除胰蛋白酶的抑制物。3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋

4、白酶/EDTA(0.05%的胰蛋白酶,消化5min。4、为了使细胞分散开,轻轻吹打细胞。5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA,加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中,吹打几次,使细胞分散为单个的。7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中,放在37培养箱中进行培养。注释:MEF培养基成分:89% DMEM (Gibco # 12100-04610% FBS (Gibco # 16000-0441% NEAA (Gibco # 11140-050MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是

5、1:5,但是最后一次的传代(第4代或第5代比例应该是1:2。小鼠胚胎成纤维细胞的冻存重悬培养基:80% DMEM20% FBS1% NEAA冻存培养基:60%DMEM30%FBS20%DMSO1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。2、加入胰蛋白酶/EDTA37消化大约5min。3、将细胞吹打下来。4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在,可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。6、取上清液,将其分装到锥形管中,1000rpm离心5min。7、每个冻存瓶中加入0.5ml(冻存液的一半体积的重悬培养基重悬细胞。8、逐滴加入等体积的(0.5

6、ml/瓶冻存培养基,混匀。现在DMSO的浓度是10%。9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。10、迅速将细胞转移到冻存的容器中,-70冻存过夜。(细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。注释:提前标注好冻存细胞的以下信息:细胞系名称传代的代数冻存细胞的数目日期Initials注明冻存/解冻形式小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏1、将冻存瓶从液氮中取出。2、放在37水浴中快速解冻,being careful not to immerse the vial above the level of the cap.3、当仅还有一点冰晶残留时,用95%的乙醇消毒冻存瓶

7、的外面,并将其置于hood中。(为什么用95%的乙醇消毒?hood是什么?4、轻轻地上下翻转细胞一次,将它们放入15ml锥形管中。5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快了对细胞将是一种打击,你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。6、1000rpm离心5min。7、将细胞重悬于10ml培养基中,然后放入T75培养瓶中。8、放入37培养箱。9、注明冻存/解冻的形式,以更新数据。网友观点是:1、关于如何确底胚胎期12.5d13d的小鼠?希望大家能够介绍一下自己所采用的方法,集思广益。我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠,到成熟(810 w后,分三周合笼,(每周合笼一

8、对,然后待最早合笼的小鼠产崽后,再取另两个雌鼠的胚胎。不知道这样行不行,也没注意别人是怎样做的。另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。2、关于提取MEF的比较好的protocol3、关于MEF转染时起耐受性如何?这个我以后主要做这些,可能会积累一定的经验,但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作,希望能够分享经验。4、关于其分泌细胞因子能力?我从一些文献上发现,MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外,也是研究天然免疫的重要材料,如日本东京大学的AKIRA的实验室,大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。从这些文献可以看出,MEF分泌细胞因子能力远

9、远强于HEK293等工程细胞,相当于肝实质细胞,略低于几种免疫细胞。但较免疫细胞,我认为有其不可替代的优势:(1其并不是主要发挥免疫功能的细胞,只有在受到外界刺激时才会应答,分泌细胞因子,免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子,即使有严格的control 组,但专门的免疫细胞即使是同一种细胞(DC,NK,T但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。会造成control 相对不一致。(2另一方面,由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的,不太容易转染,结果阳性率也会较低。(3现在的分离MEF的方法很便宜,不复杂,而分离纯的免疫细胞(如NK,DC,需要MACS,FACS等,这对目前国内

10、的实验室经费相对紧张的情况来说,不是很划算。因此除非是需要研究某一种免疫细胞,如果是为了研究天然免疫或者adaptive immune过程中某中基因,或者蛋白,或者某一信号通路等的作用,MEF 细胞不失为一种选择。网友观点:1、我每次取的是1618天的胚鼠个人觉得无碍我倒更喜欢大一点的胚胎更好操作一点2、我取的是皮肤 然后胰酶 4 度消化过夜 第二天终止消化 撕掉表皮 留下真皮 减碎 用的 100 目滤网过滤 这个胰酶消化的时间是个关键 时间长了 细胞容易死 时间少了，表 皮不容易揭下来 我有此就是这样 消化了 15 个小时 结果接种下来的细胞不能贴壁 全死了 3、我用的培养液是 DMEM+1

11、0%小牛血清 培养液也是关键 因为虽然都是成纤维细胞 比较泼辣 但总归是原代 可能还是比较娇嫩 我前几天就是这样 后来发现是培养液出的问 题 测的 PH 值都 8.3 了 细胞不死才怪 毕竟细胞耐酸不耐碱 4、原代培养的最大天敌还是污染 网友观点： 网友观点： MEF 对培养基和血清的要求不高， 一般的都行我用过高糖 DMEM 和 D/F-12， 生长情况 都行，而且看不出什么差别。血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错， 因为要养干细胞，所以现在换成进口 Gibco 胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态 确实好了一些。我的血清浓度一般是 16.66666%。 网友观

12、点： 网友观点： 细胞没别的，就是很容易老化，一般我都是 1:51:3 传代，3 代之后细胞就出现衰老 了，我感觉年轻增殖能力强的 MEF 应该有着清晰的细胞轮廓，细胞立体效果不错，在相差 显微镜下，细胞核清晰，细胞纤长，正在分裂或是刚刚分裂的细胞没有伸出伪足，但是同样 有着更加明亮的轮廓，与细胞边缘相比， 细胞呈深色（我觉得是透光效果不好）。 一般在 4× 下观察最能看出细胞的状态，此时能看到细胞呈梭形或是三角形。细胞铺展很厉害，细胞的 透光效果增加，说明开始衰老。衰老的 MEF 最好不要做 feeder,但是也不是完全不好。但是 要是做转染或是感染的话，出现衰老的 MEF 就不行了。所以一般就是 3 代以内做。 我们用的就是 WiCell 的 protocal 养， 和前面那位战友发的差不多。 只是我们用 1mg/ml Collengase