大鼠局灶性脑缺血细胞因子介导的中性粒细胞化学吸附剂的动态观察

1、    大鼠局灶性脑缺血细胞因子介导的中性 粒细胞化学吸附剂的动态观察        【摘要】目的：探索细胞因子介导的中性粒细胞化学吸附剂（CINC）在脑缺血损伤中的作用。方法：用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型，观察不同脑缺血时程血浆（sera）和脑组织内CINC浓度与髓质过氧化物酶（MPO）活性。结果：缺血组，血浆中CINC浓度的高峰在缺血6小时，脑组织内CINC浓度和髓质过氧化物酶（MPO）活性均呈低水平，其中CINC浓度高峰在缺血12小时，与对照组比较，差异均

2、有极显著性意义（P<0.01）；血浆中MPO活性随着缺血时间延长而逐渐升高，缺血6小时以上各组与对照组比较差异均有极显著性意义(P<0.01)；脑组织内各组MPO活性差异无显著性意义(P<0.05)。结论：缺血时，脑组织内表达的CINC可能是启动缺血性脑损伤的因素之一。【关键词】细胞因子介导的中性粒细胞化学吸附剂 髓质过氧化物酶局灶性脑缺血Dynamic investigation of cytokin-induced neutrophil chemoattractant in rats with focal cerebral ischemiaCao Xuebing,Huan

3、g Huaijun,Wang Fenxia.Department of Neurology.the Union Hospital of Tongji Medical University,Wuhan 430022【Abstract】Objective： To explore the effect of cytokin-induced neutrophil chemoattractant(CINC)in ischemic cerebral injury.Methods： In different time,the concentrations of CINC and the activities

4、 of myeloperioxidase(MPO)were observed in rats with focal cerebral ischemic model rats made by thread embolism method.Results： The peaks of the CINC concentrations in sera were in 6 hour and cerebral tissue in 12 hour after ischemia respectively,which were significantly higher than those of the cont

5、rol(P<0.01);The MPO activities of cerebral tissues in ischemic groups were no significant change(P>0.05),Following the ischemia,the MPO activities in sera elevated accordingly.the MPO activities after 6 hour ischemia were significantly higher than those of the control(P<0.01).Conclusion： Th

6、e CINC may be a trigger resulting in ischemic cerebral injury during the cerebral ischemia.【Key words】Cytokin-induced neutrophil chemoattractant(CINC)Myeloperioxidase Focal cerebral ischemia脑缺血造成的脑损伤是目前脑缺血研究的热点之一，缺血灶中炎性细胞的出现被认为是缺血性脑损伤的重要因素。中性粒细胞是体内炎性反应时白细胞浸润早期的主要细胞，而近年研究发现的细胞因子介导的中性粒细胞化学吸附剂(CINC)是一种

7、特异性趋化中性粒细胞的细胞因子。本实验观察了局灶性短时脑缺血时缺血侧大脑中动脉（MCA）供血、大脑前动脉（ACA）供血区（即同侧未缺血区）以及血浆（Sera）中CINC、髓质过氧化物酶（MPO）含量变化，以探讨CINC在脑缺血时的作用。1材料和方法健康雄性Sprague-Dawley（SD）大白鼠，由湖北医科大学实验动物饲养中心提供。CINC测定试剂由日本国岗山大学免疫系李君武博士赠送。1.1动物模型：采用Zea Longa报道1的大白鼠局灶性脑缺血再灌注线栓模型。1.2动物分组：将64只雄性SD大白鼠，体重225g250g，随机分为对照组、缺血1、3、6、12、24、48、72小时（h）共8

8、组。每组动物均为8只。其中每组6只大鼠用作免疫及生化检测，其余则用于组织病理学观察。1.3髓质过氧化物酶（MPO）测定：缺血区MPO活性测定用Barone等2报道的方法。MPO活性用标准溶液计算。IU MPO定义为：25下每分钟分解1mol过氧化物。1.4CINC水平测定：处死动物前行心脏采血留取血标本待检：采血完毕立即断头取脑，MCA梗死区、ACA区脑组织按时间点切除；每组脑组织都先经TTC染色以确定缺血区范围。用5倍体积PBS（含0.5%小牛血清,0.05%Tween-20）用匀浆器(100mg 湿重/0.5ml)捣碎脑组织,匀浆液离心3000rpm×15min，4。收集上清于-

9、80保存待检。按ELISA法测定标本中CINC水平。1.5统计学处理：结果以平均值±标准差表示（±s）；采用非配对资料的t检验，检验水准=0.052结果2.1 各组缺血区脑组织内和血浆中MPO活性都处于较低水平。缺血3h内测不出MPO活性，缺血12h才开始升高，高峰在缺血24h，高峰期后MPO活性逐渐下降。MCA、ACA区活性在缺血6h72h各组间差异均无统计学意义（P>0.05）。血浆中MPO活性于缺血6h后逐渐升高，缺血72h达高峰。缺血6h以上各组MPO活性对照组比较，差异均有极显著性意义（P<0.01）。见表1表1不同缺血时间MCA、ACA区和血浆MPO

10、活性变化缺血时间(小时)MCA区 (U/g)ACA区 (U/g)SERA (U/ml)对照组00 0.01±0.0021 0 0 0.01±0.0023 00 0.01±0.0026 0.025±0.002 0.02±0.003 0.02±0.002*12 0.03±0.0020.025±0.0020.05±0.01*24 0.04±0.0050.030±0.0020.08±0.01*48 0.04±0.002 0.020±0.002 0.10±

11、0.005*72 0.03±0.003 0.020±0.0050.15±0.01*注：与对照组比较*P<0.012.2不同缺血时间,脑组织内和血浆中的CINC浓度都处于较低水平。缺血侧脑组织内CINC开始出现于缺血3h，高峰期位于缺血12h，以后逐渐下降，缺血72h时仍明显高于对照组。缺血3h以上各组MCA和ACA区CINC浓度都高于对照组，差异分别都有极显著性意义（P<0.01）,缺血12h24h组MCA区CINC浓度都高于同期ACA区CINC的浓度,差异也分别都有极显著性意义(P<0.01)。血浆中CINC于缺血3h开始升高，缺血6h达高峰，

12、以后逐渐下降并于缺血48h后恢复正常，而缺血72h已检测不出。缺血3h以上各组血浆CINC浓度均高于缺血1h组，差异分别都有极显著性意义（P<0.01）。见表2 表2不同缺血时间MCA、ACA区和血浆中CINC水平缺血时间(小时)MCA区(U/g)ACA区(U/g)sera (ng/ml)对照组0.12±0.020.11±0.02010.15±0.030.14±0.040.06±0.0230.58±0.08*0.40±0.04*0.15±0.0561.10±0.22*0.80±0.15*0

13、.55±0.05124.97±0.63*¤ 3.66±0.41* 0.25±0.06243.50±0.40*¤2.08±0.54* 0.11±0.04482.11±0.60*1.20±0.58*0.06±0.03721.50±0.50*0.80±0.24* 0注：与对照组比较*P<0.01;与同期ACA比较¤P<0.01 与缺血1h比较P<0.01 3讨论脑缺血引起的急性时相反应包括炎性反应,如细胞因子的产生、发热、补体激活、白

14、细胞聚集、急性时相蛋白合成、组织内中性粒细胞浸润等。脑缺血及缺血再灌注早期向脑组织内浸润的白细胞是以中性粒细胞为主，中性粒细胞向脑组织内的浸润是受到多种细胞趋化物质所引导的，如C5a,LTB4,PAF以及其它细胞因子等。鼠CINC趋化中性粒细胞的作用与人TL-8相同，被认为是一种人类IL-8样分子3。CINC能特异性地引导中性粒细胞向血管外移动，但是鼠脑缺血时的炎性反应中CINC浓度的动态变化及其作用的报道甚少。在本研究中，MCA区的血供被线栓阻断成为缺血区域，而其同侧的ACA区并未缺血，可以作为同侧未缺血区的代表。本实验结果发现，脑缺血既能引起缺血区CINC浓度升高也能诱导同侧周边未缺血区C

15、INC的产生而缺血对侧脑组织不受影响。Karakurun等4报道,低氧或缺氧状态可诱导中性粒细胞,单核细胞和血管内皮细胞产生CINC/IL-8,但其幅度不高而同时伴有IL-8 mRNA表达增加；我们推测较长时间的缺血是启动细胞分泌CINC的因素之一，较长时间的缺血也诱导了CINC的产生，但产生量很少。Wang报道5，缺血6h后缺血侧脑内细胞因子，如TNF-及IL-I产生增多。鼠CINC3最初是在IL-I和TNF-刺激NRK-52E细胞株时被发现的，两者具有强烈的诱生CINC的能力。Liu6和Yamasaki等7报道脑内在缺血早期即有CINC mRNA的表达。随着缺血时间的延长，这两种因素的作用

16、逐渐减弱，致使CINC浓度衰减。外围血中CINC的变化可能与氧浓度变化因素占主导作用有关。Abe等8报道在急性心肌梗死早期，血清中IL-8浓度呈短暂性升高，可作为心肌梗塞的早期预报指标。本组资料中，外周血CINC浓度短暂升高的意义仍有待观察。MPO是中性粒细胞和单核细胞所特有的细胞内酶，而单核细胞内此酶的活性较低，因此，以MPO活性反映组织内中性粒细胞积聚并作为炎性细胞浸润的定量指标是很有价值的2。Matsuo等9认为缺血1h提供了足够的刺激诱导缺血脑区血管内中性粒细胞聚积。本实验中，各组缺血区脑组织内MPO活性都处于较低水平，间接表明脑缺血时中性粒细胞的出现得晚且数量可能也较少。本实验结果还

17、发现CINC与MPO的变化存在着一个时间差，提示CINC在脑缺血时可能起着中性粒细胞趋化剂的作用并与缺血性脑损伤有密切的关系。中性粒细胞在脑缺血病理变化中的作用包括10：阻塞微血管，释放血管收缩介质，增加血管通透性，释放水解酶破坏脑实质和活性氧的产生等。通过这一部分的研究，我们初步探讨了局灶性脑缺血损伤时CINC的浓度变化以及作用。随着对CINC的研究，我们认识到在积极争取血管再通的同时不应忽略CINC引起的脑缺血损伤作用。作者单位：430022同济医科大学附属协和医院98级博士生曹学兵孙圣刚湖北医科大学附属第二医院神经内科黄怀钧王风霞参考文献1Longa EZ,Weinstein PR,Ca

18、rlson S,et al.Reversible middle cerebral artery:occlusion without cranietomy in rats.Stroke,1989，20:84902Barone FC,Hillegass LM,Price WJ,et al.Polymorphonuclear leukocyte infiltration into cerebral focal ischemic tissue:myeloperoxidase activity assay and histologic verification.J Neurosci Res，1991，2

19、9:3363483Watanabe K,Kinoshita S,Nakagawa H,et al.Purification and characterization of cytokineinduced neutrophil chemoattractant produced by the epithelioid cell lineof normal rat kidney(NRK-52E cell).Biochem Biophys Res Commun,1989,161:109310954Karakurum M,Shreeniwas R,Chen J,et al.Hypoxic inductio

20、n of interleukin-8 gene expression in human endothel cells.J Clin Invest,1994,93:156415705Wang X,Yue TL,Barome F C,et al.Demonstration of increased endothelial-leukocyte adhesion molecule-1 mRNA expression in tat ischemic cortex.Stroke,1995;26:166516736Liu T,Young P R,McDonnell PC,et al.Feuerstein,Cytokine-induced neutrophil chemoattractant mRNA expressed in cereb