杜仲含药血清诱导骨髓间充质干细胞定向分化蛋白质组学研究

1、杜仲含药血清诱导骨髓间充质干细胞定向分化蛋白质组学研究         10-08-25 15:29:00     编辑：studa20                   作者：曾建春 樊粤光 刘建仁 易春智 阎亮【摘要】【关键词】  杜仲骨髓间充质干细胞蛋白质组学双向电泳Key wor

2、ds:Duzhong（Cortex Eucommiae）；  MSCs；  Proteome；  Two-dimensional electrophoresis    骨髓间充质干细胞（MSCs）是一种多功能干细胞，在不同条件下可向成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等分化。中医学认为，肾藏精，主骨，生髓，经前期研究发现，杜仲含药血清能够诱导MSCs向成骨细胞分化并促进细胞增殖，但对于MSCs向成骨细胞分化这一复杂过程的机制缺乏相关研究。    蛋白质组学研究是后基因组学时代又一重要研究工具，已经广泛应用到生命科

3、学各个领域。本文建立补肾中药杜仲含药血清干预 MSCs体外定向分化为成骨细胞过程，采用蛋白组学技术分析MSCs分化过程中不同时间点蛋白表达的变化情况，从蛋白质分子水平上解释杜仲干预 MSCs分化的可能机理。1  器材1.1  动物SPF SD大鼠2只，体质量150200 g，雌雄不限，由广州中医药大学实验动物中心提供。1.2  试剂L-DMEM培养基、南美洲胎牛血清（FBS、海克隆），杜仲（产地云南），0.25%胰酶（GIBCO公司），矿物油、标准蛋白、CHAPS、DTT、Indoacetamide（sigma），尿素（BBI），硫脲（天津市化学试剂一厂），PH3

4、-10两性电解质（Bio-Rad），考马斯亮蓝 ( G2 250、R2 250 )、低熔点琼脂糖、苯甲基磺酰氟( PMSF)、三羟甲基胺基甲烷(Tris)、N,N'-甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基磺酸钠 ( SDS)、溴酚蓝、甘油、无水碳酸钠、硫代硫酸钠、 三氟乙酸(TFA)、无水甲醇、无水乙醇、冰醋酸为国产分析纯，购于广州威佳公司。2  方法2.1  杜仲含药血清的制备取杜仲药材粗粉150 g，加70%乙醇10倍量，加热回流两次，1 h/次，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至300 ml，室温冷却，4冰箱保存备用。将中药药液稀释至0.3 g生药/ml灌胃，1 ml/

5、次，2次/d，连续给药4 d，最后一次给药后1 h经腹主动脉采血，室温静置3 h后置4冰箱过夜，2 500 r/min离心20 min，收集上清液，针头滤器过滤除菌，置-20保存备用。2.2  MSCs 分离、纯化、扩增、诱导SD大鼠以10%水合氯醛0.7 ml经腹腔麻醉后，75%酒精浸泡颈部以下躯体5 min，无菌条件下取出双下肢股骨和胫骨，修洁软组织后，咬骨钳修剪骨端，暴露髓腔，10 ml注射器吸取含10%胎牛血清的L-DMEM培养基反复冲洗髓腔，至到骨质外观微微透亮。25 cm2培养瓶收集骨髓冲洗液，放37、5%CO2孵箱培养，每3天换液1次。当原代长满瓶底90%以上时0.25

6、%胰酶消化后11传代至75 cm2培养瓶，当细胞长满75 cm2培养瓶时，以0.25%胰酶消化后12传代至长满4瓶75 cm2培养瓶，再以11传代至175 cm2培养瓶，当细胞长满瓶底80%时其中3瓶加入含10%杜仲血清的L-DMEM，余下的一瓶细胞立即0.25%胰酶消化后收集细胞，并分别于诱导后第2天、第7天、第14天同法收集细胞，置-80保存备用。2.3  细胞总蛋白的提取及定量细胞解冻后用10 mmol/L Tris/250 mmol/L Srirose（pH 7.0）洗涤3次，加入2 ml裂解液8 mol/L 尿素，4%（W/V）CHAPS，65 mmol/L DTT，2%P

7、Harmalyte-10混匀，加50 g/ml RNase及200 g/ml Dnase，在4放置15 min，再14 000 r/min，4离心30 min，上清bradford法测浓度，-80保存。2.4  第1向等电聚焦从冰箱中取出IPG预制胶条，用溶胀缓冲液（8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，0.5CHAPS,0.52%两性电解质，0.02溴酚蓝，1DTT）将胶条泡胀12 h。将胶条取出放入聚焦槽内，加入矿物油至没过上样杯，上样量为0.6 mg，并用溶胀buffer稀释至190 l。对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序（表1）。聚焦结束的胶条，立即进行平衡，第2向S

8、DS-PAGE电泳。表1  等电聚焦程序（略）2.5  胶条平衡将胶条放入平衡缓冲液I（50 mmol/L Tris-HCl 6.8，6 mol/L尿素，30甘油，2% SDS，2 DTT，0.02 溴酚蓝）水平振荡15 min，再将胶条转入平衡缓冲液II（50 mmol/L Tris-HCl 6.8，6 mol/L 尿素，30甘油，2% SDS，2.5IAA，0.02 溴酚蓝）水平振荡15 min。2.6  第2向聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳胶条平衡之前配制丙烯酰胺凝胶4块，分离胶浓度为12%配制如表2。表2  聚丙烯酰胺凝胶的配置（略）2.

9、7  考马斯亮蓝染色将凝胶放入装有染色液（10硫酸铵，10磷酸，0.12G250，20甲醇）的水平盘内，并将水平盘置水平摇床上水平振荡过夜。收集染色液，将凝胶浸于脱色液（3冰醋酸溶液）中，水平摇床振荡。最后换成MQ再洗涤30 min。2.8  图像分析及蛋白鉴定图像分析及蛋白鉴定：染色后的凝胶用水洗净后，采用扫描仪进行扫描成像，扫描分辨率设为300 dpi。考染图像分析采用PDQuest软件 (Bio-Rad)进行分析；分析过程包括点检测和编辑、建立和编辑比较组、比较组的数据分析及点的计数和解释等，具体方法参照软件操作说明进行。通过对分析胶的对比分析，可以找出比较组中表达呈现差异的蛋白点，这些差异蛋白点在考染凝胶中的对应蛋白斑点将作为质谱分析对象。    对目标蛋白点进行胰蛋白酶酶切，提取多肽混合物。取0.3 l肽段提取液，与等体积-氰基- 4-羟基肉桂酸饱和的0.1TFA/50乙腈溶