应用Fura-ⅡAM检测大鼠多形核中性粒细胞内游离钙浓度

1、    应用Fura-/AM检测大鼠多形核中性粒细胞内游离钙浓度        摘要：应用Fura-技术，检测大鼠无菌性炎症时腹腔多形核中性粒细胞(PMN)内游离钙浓度(Ca2+i)及中药锦灯笼苦味素B对其影响。结果：在静息状态下，PMN内Ca2+i为(319.43±189.05)nmolL，酵母多糖激活可使Ca2+i成倍增加，两者相比P0.05。中药可抑制Ca2+i增加。各组之间差异显著(P0.05)。并探讨了Fura-检测PMN内Ca2+i的可行性及证明中药可抑

2、制Ca2+i。关键词：钙离子荧光指示剂；Fura-；中性粒细胞；钙离子；锦灯笼苦味素B Using Fura-/AM to Examine the Concentration of Free Calcium in PMN of RatYang BingHe JiyuanLv Huan(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)ABSTRACT: Using Fura- technique, examine the concentration of free calcium in rat celiac p

3、olymorphonuclear neutrophile granulocyte (PMN) under aseptic inflammation condition and the effect of bitter principles B of the Chinese lantern-plant on it. Results: In resting state, the Ca2+ in PMN was 319.43+189.05nmol/L, the activation by zymosan could increase the Ca2+ remarkably, P<0.05. T

4、he Chinese medicine can inhibit the increase of Ca2+. Differences between the groups were apparent, P<0.05. The feasibility of using Fura- to examine Ca2+ in PMN was discussed as well and it proved that the Chinese Medicine could inhibit Ca2+.KEY WORDS: Calcium fluorescent indicator; Fura-; Neutr

5、ophile granulocyte; calcium; Chinese lantern-plant; Bitter principles B.Fura-是近年来发展起来的新一代钙离子荧光指示剂，可用于细胞悬液、培养细胞、完整组织及单个细胞Ca2+i的测定13。多形核中性粒细胞(polymorpho nuclear leukocyte,PMN)是机体防御感染的屏障，是炎症过程中的主要杀伤细胞。锦灯笼常用于上呼吸道感染性疾病，临床效佳，苦味素B(physalin B,phB)为其主要成分。本文从方法学上探讨了用Fura-测PMN内Ca2+i的可行性以及观察中药单体phB对其影响，并对机理进行了初

6、步分析。1材料和方法1.1药品与试剂Fura-/AM，中国医学科学院药物研究所产品，用DMSO溶解成1mmol/L贮备液，-20避光保存；RPMI-1640培养液，用2.08g粉末(日水制乐株式会社提供)加小牛血清白蛋白(Sino-American Biotec Bpo315,From BM)0.2g，溶于200mL超纯水，调pH 7.4后高压灭菌，4保存。酵母多糖(Zymosan A)购自SIGMA公司；Trito-100由北京中医药大学组胚教研室提供；Hepes购自Woodland,USA公司；锦灯笼注射液由北京中医研究所提供，其他药品为市售分析纯，溶液均为超纯水配制。1.2调理酵母多糖的

7、制备将100mg酵母多糖加入10mL D-HanKs溶液中，煮沸30min,2 000r/min离心10min,弃上清，沉淀物加血清10倍(用D-Hanks液15稀释)覆盖，37恒温振荡水浴孵育30min，用D-Hanks液洗2次，加至5mL(终浓度20g/L)，-30冰箱保存。1.3细胞悬液的制备Wistar大鼠，雌雄不拘，200g左右，腹腔注入2%糖原溶液8mL，68h后乙醚麻醉(心脏取血，待分离血清备用)用冰Hanks液冲洗腹腔3次，洗出液800r/min离心5min，弃上清，反复洗3次。若有红细胞则加Tris-NH4Cl液洗12次。将细胞悬浮在5mL RPMI-1640液中，计数细胞。

8、用RPMI-1640调细胞浓度5×109/L，每支试管2mL。伊文氏蓝染色，要求细胞存活率95%。将试管分为4组，正常组不加任何试剂，氯化钾组、酵母多糖组分别加200L氯化钾溶液和200L调理酵母多糖。中药组加入2.5L锦灯笼注射液，37恒温振荡水浴孵育10min,用D-Hanks液洗2次，加入2mL RPMI-1640，酵母多糖200L。1.4Fura-负载及荧光测定上述各试管细胞悬液加入Fura-/AM(终浓度为5 mol/L),37恒温振荡水浴孵育30min，D-Hanks液洗2次，调细胞悬液为5×109/L。测定前细胞预先于37复温23min。MF-4 HITACH

9、I分光光度计荧光测定。测定条件：激发光栅5nm，发射光光栅10nm，以300400nm扫描激发光谱(峰值360nm，说明Fura-已负载进入细胞内)，固定激发光波长340nm，发射光波长490nm，观察不同实验条件下荧光强度的变化。由下式计算出Ca2+i2+反应的解离常数，为224nmol/L；F为不同实验条件下的荧光强度：Fmax为最大荧光值，由加入Triton-X100(终浓度为0.1%)测得；Fmin为最小荧光值，由加入100L 0.1mol/L EGTA(pH8.5)测得。2结果酵母多糖组使PMN细胞内Ca2+i增加显著，(P0.05)。中药组有降低Ca2+i的趋势，氯化钾组作用不明显

10、。应用方差分析，组间差异F值3.61，有统计学意义(P0.05)。应用Q检验，酵母多糖组与正常组、酵母多糖组与氯化钾组Q值分别为4.02、4.08均P0.05(见表1)。表1应用Fura-/AM对炎症大鼠PMN细胞内游离钙浓度的测定结果组别n游离钙离子浓度正常组4319.43±189.05氯化钾组6309.14±253.01酵母多糖组5971.31±612.84*中药组6629.06±282.28     注：与正常组比较*P0.05；与氯化钾组比较P0.053讨论细胞内钙的变化是细胞内一种有效信号，通过测定细胞内

11、游离钙的含量及药物治疗后的改变，可提供它与疾病间关联的直接证据和阐明药物作用的机制和环节4。加入氯化钾激活剂，当有细胞外钙存在时，可使荧光强度发生变化1。本实验以无钙D-Hanks液悬浮，结果并未使Ca2+i增加，从侧面说明高钾系通过打开电压依赖性钙通道，使钙内流增加。但是，细胞效应与细胞内各种离子如Ca2+、K+、Cl-等及其浓度有关，D-Hanks液有各种离子，加入的氯化钾溶液可能使一些离子发生跨膜转运，从而间接使细胞内Ca2+i发生变化。此外，PMN是炎症病理状态下的细胞，其本身Ca2+i与正常生理状态下应该有异，其膜上各种通道状态如何，还未有实验给予解释。加入酵母多糖，具有明显激活作用

12、，可激活替代补体途径，激活PMN。此时已属离体实验，只能靠细胞内物质的反应。PMN在激活状态下Ca2+i升高，推测可能通过细胞内的钙贮池及细胞器的钙离子通道开放，Ca2+依其与细胞内的Ca2+梯度经被动转运由钙贮池及细胞器释放至细胞内。或者Ca2+从细胞内的结合部位释放5。加入中药锦灯笼苦味素B，虽无统计学意义，但有降低Ca2+i的趋势。其抗炎机理有可能是抑制PMN的激活，从而引起Ca2+i的降低。锦灯笼苦味素B作用可能是抑制了PMN活化时氧自由基的产生，但氧自由基的活性与Ca2+浓度之间是何关系，尚须进一步实验论证。作者简介：杨冰，女，26岁，医学硕士，助教作者单位：北京中医药大学北京100029参考文献1李明，王峻峰，韩济生，等.应用Fura-/AM检测分离的神经细胞内游离钙及其变化.药学学报，1991，26(12)：8908942Grynkiewioz G etal Anew generation of Ca2+ indicators with greatly improred duorescence properties.J Biol Chem,1985