双色荧光原位杂交检测慢性粒细胞白血病的bcrabl融合基因

1、    双色荧光原位杂交检测慢性粒细胞白血病的 bcr/abl融合基因        自1984年发现了慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)具有bcr/abl融合基因1，2，检测bcr/abl融合基因就成为诊断CML的关键。Tkachuk等3使用间接标记的荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术检测bcr/abl融合基因。应用FISH技术比逆转录聚合酶链反应(reve

2、rse transcript polymerase chain reaction,RT-PCR)及细胞遗传学技术更加可靠和灵敏地检测出CML和部分急性淋巴细胞白血病患者的bcr/abl融合基因4，5。我们应用双色荧光原位杂交(dual-color FISH，D-FISH)技术，检测15例CML患者的骨髓染色体标本和骨髓涂片bcr/abl融合基因。 1对象和方法1.1对象(1)病例组：CML的临床诊断及分期标准参照文献6进行。Ph染色体阳性的CML病例共15例，其中，男性13例，女性2例，年龄2063岁，平均39±13岁。各病例的骨髓染色体检查结果见表1。(2)阴性对照组：7例，平均年

3、龄为40±14岁，与病例组年龄无显著差异(P0.05)。其中，正常人2名，另外5例分别为早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、全血细胞减少、继发性粒细胞减少、恶性淋巴瘤患者，细胞遗传学检查无Ph染色体及其它染色体畸变。(3)材料：15例采用骨髓细胞染色体标本，其中3例还采用了骨髓涂片标本。两名正常人取外周血染色体标本进行杂交检测。表1实验组15例CML的细胞遗传学和D-FISH资料例号性别骨髓细胞核型例数D-FISH涂片*染色体113男46，XY，t(9;22)131321415女46，XX，t(9;22)221合计-1515/153/3*仅有3例患者做了骨髓涂片检查 1.2方法

4、1.2.1标本处理(1)骨髓染色体制备：无菌条件下抽取骨髓0.50.8ml，分成两份放入含有20%小牛血清的1640培养液中，置于37进行短期培养。其中一瓶培养2小时后收获细胞，另一瓶则进行同步化短期培养，次日收获。制片和染色体显带方法按常规进行。(2)骨髓涂片：骨髓1滴，涂在载玻片中央(稍微涂厚)，晾干后用甲醇冰乙酸(31)固定5分钟再晾干，然后用0.025%胰蛋白酶(1/15 mol/L PBS,pH7.0，37)消化5分钟，再固定5分钟后晾干备用。1.2.2融合基因探针美国VYSIS公司提供，bcr基因探针长度约为300kb，覆盖22号染色体长臂远侧端(3端)自第13外显子至近着丝粒端(

5、5端)包括m-bcr的区域，用异硫氰荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)直接标记。abl基因探针长度约200kb，覆盖9号染色体长臂远侧端abl基因第5外显子至端粒的区域，用罗达明(rhodamine)直接标记7。1.2.3FISH操作步骤将玻片标本浸入73 70%甲酰胺溶液中变性5分钟，取出立即置入预冷在-20的70%乙醇中固定2分钟，再经乙醇系列脱水，空气干燥备用。取abl基因探针和bcr基因探针混合物(美国VYSIS公司)1l与杂交缓冲液9l混合，置73水浴中变性5分钟，然后滴至预温在45的待杂交玻片上，盖上盖玻片，用橡胶水封片，置于37密闭湿盒内杂交

6、1620小时，揭下盖玻片，依次浸入45 50%甲酰胺漂洗2次，每次10分钟，再分别经45 2×SSC漂洗10分钟，45 2×SSC/0.1%Np-40漂洗10分钟，避光空气干燥3060分钟，用0.01%(w/w)二氨基酚吲哚(DAPI)复染，盖上盖玻片，橡胶水封片。用Olympus BX60荧光显微镜检查杂交结果，用Olympus PM30显微照相机多重曝光分别记录两种探针在同一个间期细胞或中期分裂相中所发出的荧光信号。2结果2.1对照组7例的杂交结果全部为阴性。在正常细胞内，bcr基因和abl基因以等位基因形式存在，即2个abl基因分别在2个9号染色体的长臂末端，2个bc

7、r基因分别在2个22号染色体的长臂末端，互相不发生融合。而在间期细胞核内，4个杂交信号(2红2绿)互相不融合，见1。1正常细胞内的bcr基因和abl基因细胞核内可见：红色荧光点为abl基因()，绿色荧光点为bcr基因(?)2.2病例组15例CML患者的杂交结果全部为融合基因阳性，与临床诊断符合率为100%(15/15)，见表1。在间期核中分别观察到2个红色荧光点与2个绿色荧光点，当其中1个红色荧光点与1个绿色荧光点重叠或融合在一起时，即可判为1个bcr/abl融合基因，见2。被探针杂交上的中期分裂相中，可清楚地看到9号染色体的长臂末端分别发出红色亮点(abl探针)，22号染色体的长臂上也清楚地

8、显现绿色亮点(bcr探针)，而Ph染色体上同时显现出相连的红色亮点和绿色亮点，证明bcr/abl融合基因存在于Ph染色体上。并且，abl基因是从Ph染色体的远侧端与bcr基因融合的，见3。2有bcr/abl融合基因的白血病细胞细胞核内可见：红色荧光点为abl基因()，绿色荧光点为bcr基因(?)，红绿色(黄色)为bcr/abl融合基因(?)3bcr/abl融合基因9号染色体上的红色荧光点为abl基因()，22号染色体上的绿色荧光点为bcr基因(?)，Ph染色体上的红绿色为bcr/abl融合基因(?)3讨论应用D-FISH技术可以对CML及部分急性淋巴细胞白血病患者的骨髓细胞中期分裂相和骨髓涂片

9、进行bcr/abl融合基因检测4，5。我们用此技术检测15例Ph染色体阳性CML患者中bcr/abl融合基因，检出率为100%，而阴性对照组的检出率为0，说明此法对检测bcr/abl融合基因具有很高的特异性和可靠性。实验显示abl基因从Ph染色体远侧端与bcr基因发生融合(3)。在同时做了骨髓细胞中期分裂相和骨髓涂片bcr/abl融合基因检测的3个病例中，两种材料所得的检查结果一致。证明D-FISH技术可方便地从骨髓涂片中检出bcr/abl融合基因，应能成为临床上诊断CML的常规检查项目。本项目受云南省自然科学基金青年基金(94C038Q)资助作者单位：朱宝生李春华李永刚冯怀英王瑞红（6500

10、32昆明，云南省第一人民医院计划生育科细胞遗传室）沈晓梅史克倩赖洵（血液科）*为通信联系人参考文献1Groffen J,Stephenson JR,Heisterkamp N,et al.Philadelphia chromosomal breakpoints are clustered within a limited region, bcr,on chromosome 22.Cell,1984,36(1)93-99.2Shtivelman E, Lifshitz B, Gale RP,et al.Fused transcript of abl and bcr genes in chroni

11、c myelogenous leukemia. Nature,1985,315(6020)550-554.3Tkachuk DC, Gray J, Pinkel D, et al.Detection of bcr/abl fusion in chronic myelogeneous leukemia by in situ hybridization. Science,1990,250(4980)559-562.4Tbakhi A, Pettay J, Sreenan JJ,et al.Comparative analysis of interphase FISH and RT-PCR to detect bcr-abl translocation in chronic myelogenous leukemia and related disorders. Am J Clin Pathol,1998,109(1)16-23.5Cox MC,Maffei L, Buffolino S,et al.A comparative analysis of FISH,RT-PCR,and cytogenetics for the diagnosis of bcr-abl-positive leukemias. Am J Clin