黄芩苷对小鼠T淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响

1、黄芩苷对小鼠T淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响 作者：李林, 曾耀英*, 黄秀艳, 宋兵, 杨志, 滕菲, 姚满林【摘要】 目的: 分析黄芩苷(BA)对小鼠T淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响, 探讨其免疫抑制作用的机制。方法: 无菌分离小鼠淋巴结, 制备淋巴细胞悬液, 以羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰脂(CFDASE)染色, 不同终浓度的BA预孵育4 h, 加入刀豆蛋白(ConA)或佛波醇酯类多克隆刺激剂PDB和离子霉素Ion进行刺激, 以流式细胞术(FCM)结合荧光抗体染色技术检测黄芩苷对CD3+T细胞增殖率的影响; 以碘化丙锭(PI)染色结合FCM分析其细胞周期分布。结果: BA(10、 15、

2、 20、 25 mg/L)对ConA或PDB和Ion诱导的小鼠CD3+T细胞增殖均有明显的抑制作用（P0.05）, 且呈浓度依赖性。对细胞周期分析表明, BA能使ConA或PDB和Ion刺激的小鼠淋巴细胞停滞于G0/G1期、 S期, 阻止其进入G2/M期, 阻止作用随浓度的增加而增强。结论: BA对ConA或PDB和Ion诱导的小鼠CD3+T细胞增殖有明显抑制作用, 能够将淋巴细胞阻滞在G0/G1期和S期, 表现出明显的周期特异性。本研究提示黄芩苷有成免疫抑制剂的潜力。 【关键词】 黄芩苷; T细胞; 细胞增殖; 细胞周期中药黄芩取自唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensi

3、s Georgi)的根, 主含黄酮类成分, 已分离出40余种黄酮, 主要有黄芩苷(Baicalin, BA)、 黄芩素、 汉黄芩素等, 其中以黄芩苷的含量最为丰富。药理研究已证明, 黄芩苷有抑菌、 清热、 降压、 镇静、 利尿、 利胆、 抗炎和抗变态反应等作用1, 临床用于肺炎、 高血压、 肝炎、 感染和先兆流产等疾病。近年来的研究表明BA对免疫系统有一定的调节作用2, 但是, BA对免疫系统发挥作用的细胞和分子机制尚未完全阐明, 尤其是对T细胞所介导的免疫应答的影响鲜有报道。本研究通过分析BA对小鼠淋巴细胞增殖和周期分布的影响, 评价其免疫效应并探讨免疫作用机制。1 材料和方法1.1 材料

4、SPF级BALB/c小鼠(雄性, 810周龄)购自广东省实验动物中心; 黄芩苷购自陕西慧科植物开发有限公司（纯度98%）, 刀豆蛋白A (ConA)、 佛波醇酯( phorbol 12, 13dibutyrate, PDB)、 离子霉素(ionomycin, Ion)、 碘化丙锭(propidium iodide, PI)、 TritonX100、 Rnase、 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、 四甲基偶氮唑盐溶液(MTT)均购自Sigma公司; 羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl es

5、ter, CFDASE)购自Molecular Probes公司, antimouseCD3PE(phycoerythrin, 藻红蛋白)购自BD PharMingen公司; RPMI1640培养液、 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、 L谷氨酰胺、 青霉素、 链霉素、 巯基乙醇等购自GibcoBRL公司。流式细胞仪(FACSCalibur)为美国Becton Dickinson公司产品。1.2 方法2 结果2.2 BA对ConA刺激下小鼠CD3+T细胞增殖的影响 CFDASE标记技术是利用活细胞染料CFDASE随细胞每增殖1代, CFDASE荧光强度系列减半的特征,

6、 结合FCM, 动态追踪淋巴细胞增殖的技术, 并可通过Modfit软件进行分析增殖指数（PI, 即增殖后的细胞总数与增殖前的细胞总数的比值）和各代细胞所占的百分比（表1）。实验结果表明, 空白组细胞组仅见一个亲代峰, 无增殖峰。而在ConA刺激下细胞出现3个子代峰, 加入BA的药物实验组可明显减少子代峰和子代细胞数（图1）, 随着BA浓度的升高, 细胞分裂代数逐渐减少, PI逐渐降低, 与ConA对照组相比较具有统计学意义（P0.05）。2.3 BA对PDB和Ion刺激下小鼠CD3+T细胞增殖的影响 在PDB+Ion刺激下细胞出现两个子代峰, 加入BA的药物实验组明显减少子代峰和子代细胞数（图

7、2）, 即降低了细胞分裂代数。Modfit软件分析表明, 随着BA浓度的升高, 药物实验组细胞的PI逐渐降低, 与PDB+Ion组相比较具有统计学意义（P0.05, 表2）。表1 CFDASE染色分析BA对ConA诱导的小鼠CD3+T细胞增殖的影响（略）aP0.05, bP0.01 vs ConA; G1: 母代细胞百分率(%); G: 各子代细胞百分率 (%); PI: 增值指数.图1 BA对CFDASE标记的小鼠CD3+T细胞在ConA刺激下增殖的影响（48 h）（略）a: Control; b: ConA; c: ConA+BA 10 mg/L; d: ConA+BA 15 mg/L;

8、e: ConA+BA 20 mg/L; f: ConA+BA 25 mg/L.图2 BA对CFDASE标记的小鼠CD3+T细胞在PDB+Ion刺激下增殖的影响（48 h）（略）a: Control; b: PDB+Ion; c: PDB+Ion+BA 10 mg/L; d: PDB+Ion+BA 15 mg/L; e: PDB+Ion+BA 20 mg/L; f: PDB+Ion+BA 25 mg/L.1 2.4 BA对ConA刺激下小鼠T细胞周期的影响 未经ConA刺激的空白组T细胞主要处于G0/G1期; 经ConA刺激48 h后, 与空白组相比较, 处于S期和G2/M细胞的比率明显增加,

9、而加入BA的药物实验组与ConA组相比, 其G2/M期T细胞的比率明显减少, S期T细胞的比率稍有增加, G0/G1期T细胞显著增加, 具有统计学意义(P0.05, 表3)。2.5 BA对PDB和Ion刺激下小鼠T细胞周期的影响 未经PDB和Ion刺激的空白组T细胞主要处于G0/G1期; 经PDB和Ion刺激48 h后, 与空白组相比较, 处于S期和G2/M期细胞的比率明显增加, 而加入BA的药物实验组与PDB+Ion组相比, 其G2/M期T细胞的比率明显减少, S期T细胞的比率没有显著变化, G0/G1期T细胞显著增加, 具有统计学意义(P0.05, 表4)。表2 CFDASE染色分析BA对

10、PDB+Ion诱导的小鼠CD3+T细胞增殖的影响（略）aP0.05, bP0.01 vs PDB+Ion; G1: 母代细胞百分率(%); G: 各子代细胞百分率 (%); PI: 增值指数.表3 BA对ConA刺激小鼠淋巴细胞48 h后的细胞周期分布（略）aP0.05, bP0.01 vs ConA.表4 BA 对PDB+Ion刺激小鼠淋巴细胞48 h后的细胞周期分布（略）aP0.05, bP0.01 vs PDB+Ion.3 讨论 以往研究中发现, BA能够明显抑制T细胞活化及某些细胞因子的释放（待发表）。T细胞是免疫系统发挥作用的核心, T细胞的活化、 增殖与各种炎症性疾病有着密切关系4

11、, 5, T细胞活化和增殖是一个复杂的动态过程, 涉及多种酶和信号转导途径, 是执行细胞免疫功能的基础6。T细胞接触抗原、 经双信号刺激活化, 必须经过克隆扩增, 进而分化成效应T细胞, 才能发挥细胞免疫功能, 在此过程中活化的T细胞首先分化成Th效应性细胞, 并分泌IFN、 TNF和IL1等炎症性细胞因子, 造成瀑布式炎症失控性反应, 最终导致组织的损伤7, 因此, 增殖是T细胞发挥作用的关键环节之一, 在免疫应答中起着至关重要的作用。T细胞需要经DNA合成、 有丝分裂完成整个细胞周期才能实现增殖, 细胞周期的变化直接影响T细胞的增殖。所以, 抑制T细胞活化、 增殖以及其活化后对细胞因子的释

12、放, 将成为调控免疫系统、 免疫炎症性疾病的重要策略之一。 在本实验中, 分别采用CFDASE和碘化丙锭染色, 结合FCM, 分析在ConA或PDB加Ion刺激下, BA对T细胞增殖情况和周期分布的影响。结果表明, 各浓度的BA不仅对Con A引起的T细胞增殖有抑制作用, 对PDB和Ion刺激T细胞增殖也有抑制作用, 而且都呈浓度依赖关系, 但从增殖指数看出, BA对ConA诱导增殖的抑制作用强于对PDB和Ion的。这可能是因为ConA与PDB加Ion两者诱导T细胞增殖的机制不同。ConA作用于细胞膜上的相应受体, 需通过ZAP270、 Fyn、 Lck等上游的蛋白酪氨酸激酶(PTK)进行信息

13、传递, 进一步诱导胞内信号传导, 信使Ca2+浓度升高等而导致细胞增殖; 而PDB则是二酰基甘油(DAG)的类同物, 能绕过活化跨膜传递分子TCR/CD3等直接作用于细胞内的蛋白激酶C(PKC)8, 离子霉素Ion是Ca2+载体, 使细胞内Ca2+浓度升高, 二者协同作用使细胞增殖。可见, BA很可能是PKC的抑制剂, 在PKC通路的上游和下游也都可能存在BA的作用位点, 在上游可以作用于T细胞活化早期相关PTK（如Lck、 Fyn等）, 还可以通过作用于下游PTK或其他相关信号转导分子, 从而影响T细胞增殖。 对细胞周期分析显示, 随着BA浓度增加, 与ConA或PDB和Ion刺激的T细胞比

14、较, 处于G2/M期的细胞数逐渐减少, S期细胞数基本不变, 而处于G0/G1期的细胞数增加, 表明, BA可能通过干扰DNA的合成和分裂发挥其免疫抑制作用。有相关报道BA能抑制NFB的活性9, NFB是PKC信号通路下游重要的信号分子, 但BA对淋巴细胞增殖的抑制作用是否与对NFB的活性抑制有关, 还需待进一步研究证实。 本研究证明, BA对刺激剂ConA或PDB和Ion诱导的T细胞增殖有明显的抑制作用, 并可明显抑制G0/G1期细胞向G2/M期转化, 推测BA很可能是PKC的抑制剂, 在PKC通路的上游和下游均可能存在BA作用的靶点, BA抑制T细胞DNA合成是其发挥免疫抑制作用的机制之一

15、。本研究结果提示BA可能是一种潜在的免疫抑制剂, 值得进一步探索研究。【文献】 1 Gao ZX, Huang KX, Xu HB. Progress of studies in the bioactivities of flavonoids extracted from Scutellaria baicalensisJ. Chin Pharm J, 1998, 33(12): 705-707.2 Kim HM, Moon EJ, Li E, et al. The nitric oxide2producing activities of Scutellaria baicalensisJ. To

16、xicology, 1999, 135(2-3) : 109-115.3 肇静娴, 曾耀英, 何贤辉, 等. 活体染料CFSE在淋巴细胞增殖研究中的应用J. 细胞与分子免疫学杂志, 2003, 19(2): 109-111.4 Ferenczi K, Burack L, Pope M, et al. CD69, HLADR and the IL2R identify persistently activated T cells in psoriasis vulgaris lesional skin: blood and skin comparisons by flow cytometryJ.

17、Autoimmune, 2000, 14(1): 63.5 Leckie MJ, Jenkins GR, Khan J, et al. Sputum T lymphocytes in asthma, COPD and healthy subjects have the phenotype of activated intraepithelial T cells(CD69+ CD103+)J. Thorax, 2003, 58: 23-29. 6 尹乐乐, 曾耀英, 黄秀艳, 等. 连翘提取物对小鼠T淋巴细胞体外活化与增殖的影响J. 细胞与分子免疫学杂志, 2008, 24(1): 10-12.7 Szabo SJ, Sullivan BM, Peng SL, et al. Molecular mechanisms regulating Th1 immune responsesJ. Annu Rev Immunol, 2003, 21: 713-758.8 Sun Z, Arendt