瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的实验研究

1、    瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的实验研究        【摘要】目的探讨瘢痕疙瘩中胶原过度聚集的原因。方法从正常皮肤与活跃增生瘢痕疙瘩标本分别培养真皮成纤维细胞，采用3H脯氨酸掺入法分别检测单层培养及胶原凝胶三维培养体系中成纤维细胞的胶原合成量。用斑点杂交法检测单层培养细胞的人前1()型胶原mRNA水平。结果瘢痕疙瘩成纤维细胞型胶原mRNA水平升高，其胶原合成量也显著高于正常真皮成纤维细胞（P<0.01）。结论在增生活跃瘢痕疙瘩中，成纤维细胞胶原合成功能处于活化状态

2、，胶原合成增加是导致胶原过度积聚的重要原因。【关键词】瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原Experimental Study on Collagen Synthesisin Cultured Keloid Fibroblasts HE Wei, LIU Rongqing, ZHONG Baiyu. Department of Dermatology， Southwest Hospital，Third Military Medical University， Chongqing 400038 【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the cause of excessive

3、 collagen accumulation in keloid tissue. Methods Human dermal fibroblasts were cultured from keloid and normal skin. Collagen production by fibroblasts in monolayer culture and in collagen gel was assessed by 3H? proline incorporation . Type procollagen mRNA level of fibroblasts in monolayer culture

4、 was determined by dot blot hybridization using human pro 1() collagen? specific cDNA probe. Results The collagen synthesis significantly increased in keloid fibroblast lines(P<0.01), acompanied by a rise in type procollagen? specific mRNA levels in comparison with normal dermal fibroblast lines.

5、 Conclusion These findings suggest that the fibroblasts are activated in collagen synthesis in active keloid. The enhanced collagen synthesis by fibroblasts might contribute to excessive collagn accumulation in keloid.【 Key words】 Keloid Fibroblasts Collagen 瘢痕疙瘩是与异常创伤反应有关的一种特殊类型的瘢痕，与硬皮病以及具有硬皮病样皮肤改变

6、的一些疾病一起归入真皮纤维化疾病的范畴，还被视为起源于真皮网状层的良性纤维组织肿瘤。因此，它是研究创伤异常愈合、纤维增生和真皮纤维化的一个模型。迄今为止，瘢痕疙瘩的发病机理尚不完全清楚。为了探讨瘢痕疙瘩中胶原过度聚集的原因，我们对汉族人增生活跃的瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成情况进行了研究。材料和方法一、标本选择标准及来源为避免年龄差异以及某些疾病和药物对胶原代谢的影响，对瘢痕疙瘩患者、无瘢痕疙瘩及其形成倾向个体（以下简称非瘢痕疙瘩个体）均限定为1640岁，无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病，未系统应用皮质类固醇及其它可能影响结缔组织代谢药物的汉族人个体。根据典型临床特点确定瘢痕疙瘩的诊断

7、1，2，并经组织病理学检查证实。选择近1年内未接受局部外用药物、注射药物和放射治疗并处于增生活跃阶段的瘢痕疙瘩用于研究。为避免瘢痕疙瘩复发，手术后局部行放疗并配合醋酸确炎舒松A针剂封闭。瘢痕疙瘩及其邻近正常皮肤由本科瘢痕疙瘩专病门诊在局麻下手术切取，非瘢痕疙瘩个体的胸部正常皮肤标本由胸心外科和肾外科提供。手术获得的新鲜皮肤标本立即置于DMEM培养液中，4保存待用。二、方法(一)成纤维细胞培养：原代培养以组织块法实施3，分别从瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩相邻正常皮肤和非瘢痕疙瘩个体正常皮肤标本中培养真皮成纤维细胞，用内含10胎牛血清的DMEM（Sigma公司）培养液，在37、5CO2、饱和湿度的CO2孵箱

8、（美国SHEL-LAB1815TC型）中培养，每周更换培养液2次。待原代培养长出的成纤维细胞接近或达到融合，用0.25胰蛋白酶液消化并传代，传代培养成纤维细胞均称为细胞系（cellline）。(二)人型前胶原特定cDNA探针的制备与标记：以碱裂解法从大肠杆菌61322(American tissue culture collection,ATCC)中大规模提取含人前1()型胶原cDNA克隆Hf-677的质粒DNA，聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA，EcoRI酶切后行DNA琼脂糖凝胶电泳，得1.5kb的目的片段，用电洗脱法从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段4。用地高辛标记(Boehringer Man

9、nheim公司)前1()型胶原cDNA探针。(三)单层培养成纤维细胞胶原合成的检测：分别测定从瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩相邻正常皮肤和非瘢痕疙瘩个体正常皮肤标本中培养的真皮成纤维细胞的胶原合成量，第24代的细胞系用于研究。将细胞接种于96孔细胞培养板中（10000个/孔），每孔中加培养液200L，每一细胞系设3个复孔。为避免培养液中血清所含细胞因子对胶原合成的可能影响，检测胶原合成时统一使用含抗坏血酸(50g/mL)的无血清DMEM培养液。采用24h标记期3H脯氨酸(中国原子能研究院同位素研究所)掺入（掺入量0.5Ci/孔）稳态、融合的单层培养成纤维细胞中，用胃蛋白酶消化法检测培养液中胶原量5。该方法

10、是利用胃蛋白酶在低温下将非胶原蛋白降解，而胶原仅被切去非螺旋的末端，再用过氯酸沉淀胶原的三螺旋部分。将沉淀物收集于玻璃纤维滤膜上，然后按常规准备液体闪烁计数标本，用液闪测量仪（瑞典LKB-1217型）进行闪烁计数，测定其放射活性，以此作为培养液中的胶原量。另以胰蛋白酶液消化处理已吸去培养液的细胞，终止消化反应后，将细胞收集于玻璃纤维滤膜上，同上准备液体闪烁计数标本并进行闪烁计数，以此作为细胞内的胶原量。实验结果以dpm/1000细胞表示。(四)胶原凝胶三维培养体系中成纤维细胞胶原合成的检测：无菌条件下用大白鼠尾腱制备酸溶鼠尾胶原溶液（1mg/mL）。按1份10倍DMEM浓缩液、8份胶原溶液和1

11、份成纤维细胞的DMEM悬液的比例制备成纤维细胞胶原凝胶6。24孔培养板中每孔胶原凝胶1mL，内含105个细胞，每孔加入1.5mL培养液。检测成纤维细胞胶原合成时，每孔掺入2Ci3H脯氨酸12h。所用培养液、培养条件同上。收集并漂洗胶原凝胶,用0.1胶原酶液在37消化2h后，将样品收集于玻璃纤维滤膜上，同上准备液体闪烁计数标本并进行闪烁计数，实验结果以dpm/1000细胞表示。(五)RNA斑点杂交检测单层培养成纤维细胞型胶原mRNA的表达：用异硫氰酸胍一步法分别从单层培养的瘢痕疙瘩与非瘢痕疙瘩个体正常皮肤的成纤维细胞中提取RNA，以含人前()型胶原cDNA的质粒作阳性对照，以pBR322质粒作阴

12、性对照。将抽提的RNA和对照样品点样于硝酸纤维素膜上，用地高辛标记的人前()型胶原cDNA探针与之进行斑点杂交7，显色适度后终止反应。用薄层扫描仪（美国CS9000型）对斑点进行扫描分析。三、统计学处理采用第三军医大学数学教研室SPMR统计程序包PDA-2程序进行单因素方差分析及均数比较。结果瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩相邻正常皮肤和非瘢痕疙瘩个体正常皮肤的成纤维细胞在单层培养时的形态差异无显著性，它们在三维培养体系中的形态及收缩凝胶情况也无明显差异。在三维培养体系中，由于胶原凝胶不同层次均有细胞生长，在倒置显微镜下可见不同焦距的细胞不甚清晰（1）。    1胶原

13、凝胶三维培养体系中的瘢痕疙瘩成纤维细胞单层培养状态下，瘢痕疙瘩及其相邻正常皮肤的成纤维细胞的胶原合成量的比较见表1，瘢痕疙瘩成纤维细胞与非瘢痕疙瘩个体正常皮肤成纤维细胞的胶原合成量的比较见表2。从表1和表2看出，不论是细胞内还是培养液中，瘢痕疙瘩成纤维细胞的胶原合成量不但显著高于其相邻正常皮肤成纤维细胞，而且还显著高于非瘢痕疙瘩个体正常皮肤成纤维细胞。表1瘢痕疙瘩成纤维细胞与其相邻正常皮肤成纤维细胞的胶原合成量(<"Image361 (850 bytes)" src="/med/cano/201003/20100317190217524" 14 1

14、7>±s,dpm/1000细胞)成纤维细胞培养液中细胞内瘢痕疙瘩(4例)175.88±49.97294.38±70.20瘢痕疙瘩相邻正常皮肤(4例)109.13±10.10130.65±43.61t值2.623.96P值<0.01<0.01注：3例标本取自胸部，1例标本取自三角肌区表2瘢痕疙瘩成纤维细胞与非瘢痕疙瘩个体正常皮肤成纤维细胞的胶原合成量(<"Image361 (850 bytes)" src="/med/cano/201003/20100317190217524" 14

15、 17>±s,dpm/1000细胞)成纤维细胞培养液中细胞内瘢痕疙瘩(6例)171.07±41.35275.45±79.29非瘢痕疙瘩个体正常皮肤(5例)113.54±17.64134.12±14.99t值2.883.89P值<0.010.01注：瘢痕疙瘩与正常皮肤均取自胸部在胶原凝胶三维培养体系中，瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩相邻正常皮肤和非瘢痕疙瘩个体正常皮肤的成纤维细胞的胶原合成量分别为(41.43±13.17)、(16.43±6.21)、(14.13±5.44)dpm/1000细胞，其中瘢痕疙瘩成纤维细胞

16、的胶原合成量不但显著高于瘢痕疙瘩相邻正常皮肤成纤维细胞（t=2.90,P<0.01），还显著高于非瘢痕疙瘩个体正常皮肤的成纤维细胞（t=3.20,P<0.01）。用型前胶原cDNA探针与培养成纤维细胞中提取RNA的斑点杂交结果见2，为确定型胶原mRNA的表达量，用薄层扫描仪对杂交结果进行扫描，计算其吸收峰值，瘢痕疙瘩成纤维细胞为7133.03±268.76，正常皮肤成纤维细胞为4175.60±233.18，瘢痕疙瘩成纤维细胞型胶原mRNA量明显高于从非瘢痕疙瘩个体正常皮肤中培养的成纤维细胞。    Al-2、Bl-2、Cl

17、-2为瘢痕疙瘩成纤维细胞，A3-4、B3-4为正常皮肤成纤维细胞C3为阳性对照2 用I型胶原cDNA探针与培养成纤维细胞RNA的斑点杂交结果讨论既往对黑人瘢痕疙瘩成纤维细胞的研究发现，只有部分细胞系显示了胶原合成增加和胶原基因表达增强；但对白人瘢痕疙瘩成纤维细胞的研究却发现，瘢痕疙瘩与正常皮肤成纤维细胞的胶原合成量以及胶原基因表达无显著差异1，2。似乎瘢痕疙瘩成纤维细胞的胶原合成功能与个体因素和种族因素还有一定关系。我们还注意到，这些研究在对照皮肤解剖部位的对应性，特别是瘢痕疙瘩临床活动性的差异等方面均未很好控制，而上述因素对瘢痕疙瘩的研究特别是成纤维细胞培养的研究结果均可能产生影响。本研究以

18、汉族人中增生活跃的瘢痕疙瘩患者为研究对象，在充分注意标本选择和控制实验条件的前提下，除了单层培养外，还首次对胶原凝胶三维培养体系中瘢痕疙瘩成纤维细胞的胶原合成进行了研究，此种三维培养体系能较好地模拟成纤维细胞在活体组织中的生长环境。结果发现瘢痕疙瘩成纤维细胞型胶原mRNA水平升高，其在单层培养时的胶原合成量不但较正常皮肤成纤维细胞显著增加，并且在胶原凝胶三维培养体系中的胶原合成量仍显著高于正常皮肤成纤维细胞。这些结果表明，在增生活跃的瘢痕疙瘩中，成纤维细胞胶原合成功能处于高度活化状态，胶原合成增加是瘢痕疙瘩中胶原过度积聚的重要原因。为什么在瘢痕疙瘩中已存在胶原过度积聚的情况下，其成纤维细胞的胶原合成功能未受到细胞外胶原的反馈抑制呢？我们推测这可能与瘢痕疙瘩成纤维细胞表面的胶原受体整合素受体的表达减少有关，从而使得细胞外胶原对成纤维细胞胶原合成功能的反馈抑制作用难以发挥。作者单位：刘荣卿、钟白玉400038重庆,第三军医大学西南医院皮肤科何威现在第三军医大学新桥医院皮肤科400037参考文献1 Placik OJ, Lewis