肝血流阻断后一氧化氮供体对胰腺ATP酶活性的影响

1、肝血流阻断后一氧化氮供体对胰腺ATP酶活性的影响    关键词NO供体Na-K-ATP酶Ca2-ATP酶Effect of NO Donor on Pancreatic ATP ase Activity after Hepatic Vascular OcclusionAbstractObjective：To investigate the efffect of NO donor on the activity of Na-K-ATP ase and Ca2-ATP ase in pancreatic tissues after hepatic vascu

2、lar occulsion in rabbits with portal vein hypertensionMethods：Twenty-four rabbits of portal vein hypertension model，produced by ligating partly the portal vein，weighted from 2.0 to 2.5kg，were randomly divided into control group，sodium nitroprusside （SNP）group and N-nitro-L-arginine methyl ester （L-N

3、AME）group with 8 eachAfter anesthesia with pentobarbital sodium 30mgkg intravenously，tracheotomy was performed and femoral artery intubation was done to monitor blood pressureThen hepatic portal （including portal vein，hepatic anchoring artery and choledochus） was occluded，hepatic blood flow was rene

4、wed 60min after the hepatic portal was occludedL-NAME 10mgkg was given to each rabbit in L-NAME group 10min before the occlusion，and SNP 5g.kg1.min1 for 75min in SNP group，and nothing in control groupThe values of Na-K-ATP ase and Ca2-ATP ase activity in pancreatic tissues were measured with enzyme

5、assay method 60min after hepatic blood flow was reperfusedResults：Compared with control group，the values of Na-K-ATP ase and Ca2-ATP ase activity in pancreatic tissues in SNP group were higher distinctly （P0.05）The values of these enzyme activity in L-NAME group， however，were decreased significantly

6、 （P0.05）In comparison with SNP group，the values of these enzyme activity in L-NAME group were decreased significantly （P0.001）Conclusion：During hepatic vascular occlusion，SNP，as a NO donor，can increase ATP ase activity in ischemic pancreas and protect the pancreasKey wordsNO donorNa-K-ATP aseCa2-ATP

7、 ase肝血流阻断后，胰腺组织发生淤血性缺血，继而发生微循环障碍及功能改变，其中细胞内Na-K-ATP酶和Ca2-ATP酶活性的改变是缺血后再灌注损伤的重要环节之一。若能预防或减轻因缺血引起的Na-K-ATP酶和Ca2-ATP酶活性的降低，就有可能防止膜功能的衰竭和缺血后再灌注损伤的发生。一氧化氮（Nitric Oxide，NO）是一种血管内皮舒张因子1，具有维持微循环的稳定，调节血管通透性和器官血流，减少氧自由基产生等作用24。本文通过对实验性门脉高压模型的家兔，行肝血流阻断后，观察NO供体对胰腺组织Na-K-ATP酶和Ca2-ATP酶活性的影响。材料与方法药物与试剂左旋硝基精氨酸甲酯（L-

8、NAME）为美国Sigma公司产品，硝普钠（SNP）为北京制药工业研究所实验药厂产品，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。实验步骤门脉高压模型的制作：任意性别的家兔（2.02.5kg）术前晚禁食，应用部分门静脉结扎法5制作门脉高压模型，要点为：3戊巴比妥钠1mlkg静脉麻醉，在剑突下经腹正中线作一约8cm10cm长的切口，游离门静脉主干，经小肠系膜静脉支插管测门静脉压力，然后在门静脉主干外缘平行放置一外径为1.01.5mm钝性针头，用1号线结扎门静脉主干及与之靠近的钝性针头，拔出针头达到部分门静脉结扎目的，然后逐层关闭腹腔。手术当日补液50200ml，补液中加入庆大霉素4万U，术后每天肌注庆大

9、霉素2万U，共3天，2周后，门脉高压模型制作完成等待实验。动物分组门脉高压模型的家兔24只，随机分成三组，分别为对照组、SNP组和L-NAME组，每组8只。3戊巴比妥钠1mlkg静脉麻醉后行气管切开插管，插入细导管吸氧，经股动脉置管监测动脉血压，然后经腹正中线剑突下作一约8cm10cm长的切口，游离肝门区域，再次测量门静脉压力以证实模型制作成功（压力升高50认为模型制作成功，不足50则将其剔除），于肝门阻断前3分钟给予肝素400Ukg，肝门阻断时间为60分钟，于恢复肝血流后60分钟后取出胰腺组织；L-NAME组和SNP组于肝门阻断前10分钟经耳缘静脉分别注射L-NAME（10mgkg）和SNP

10、（5.0gkg1min1，直到肝血流开放后5分钟共持续75分钟），对照组不给任何药物，术中静滴0.9生理盐水维持血压不低于60mmHg。观测指标于实验结束后取下胰腺组织，液氮快速冰冻，超低温冰箱（70）保存，待所有实验做完后，按试剂盒说明书测定组织Na-K-ATP酶和Ca2-ATP酶活性，酶活力单位以每小时（h）分解每毫克组织蛋白（mgprot）产生的无机磷（pi）的含量（mol）来表示，单位molpimgprot1h1。采用考马斯法测定蛋白含量。统计学处理所有数据用均值±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析，以P0.05认为有显著差异。结果模型制作前后门静脉压力的变化

11、术前各组间压力比较无显著差异，术后2周各组压力均显著升高，但各组间无显著性差异(表1)。表1模型制作前后各组家兔门静脉压力的变化（cmH2O）（±s）（n8） 门静脉压力 模型制作前 模型制作后 SNP组 7.31±1.16 14.00±2.34* L-NAME组 7.69±1.46 15.56±2.65* 对照组 7.56±0.78 15.31±1.05*与同组模型制作前相比，*P0.01对Na-K-ATP酶活性的影响与对照组相比，SNP组胰腺组织的Na-K-ATP酶活性显著增高（P0.05）；在L-NAME组，

12、该酶活性则显著降低（P0.05）。L-NAME组与SNP组相比，该酶活性则极显著降低（P0.001）(表2)。表2家兔胰腺组织ATP酶活性的变化（molpimgprot1h1）（±s）（n8） Na-K-ATPase Ca2-ATPase SNP组 6.73±1.40* 6.30±1.11* L-NAME组 3.37±0.41* 2.87±0.61* 对照组 5.16±0.66 5.08±1.15与对照组比较，*P0.05与SNP组比较，P0.001对Ca2-ATP酶活性的影响与对照组相比，SNP组胰腺组织的Ca2

13、-ATP酶活性显著增高（P0.05）；在L-NAME组，该酶活性则显著降低（P0.05）。L-NAME组与SNP组相比，该酶活性则极显著降低（P0.001）(表2)。讨论肝血流阻断后，胰腺组织将发生淤血性缺血，组织缺血后由于缺氧产生的自由基，包括超氧阴离子、羟自由基以及过氧化氢等6，可以攻击生物膜的不饱和脂肪酸，诱发脂质过氧化反应进而损害细胞膜、细胞器及酶的功能7。生理条件下，细胞外（血浆）Na浓度介于130145mmolL，而细胞内低10倍，故Na倾向于进入细胞内。正常情况下，Na浓度的恒定依赖于Na-K-ATP酶活性的维持，将细胞内多余的Na化学逆梯度泵出细胞外，此过程需要消耗能量。胰腺组

14、织缺血缺氧时，细胞线粒体受累致ATP产生不足，能量匮乏，酶活性下降，细胞内Na滞留，致胰腺水肿，发生微循环障碍。因此Na-K-ATP酶活性的高低，可以作为评价胰腺缺血再灌注损伤的指标之一7。同样，胰腺缺血再灌注损伤可致胰腺细胞内Ca2超载，从而激活多种依赖于Ca2的胰酶，进一步加重胰腺的损害，因此胰腺组织的Ca2-ATP酶活性的高低也是判断胰腺缺血再灌注损伤的指标。在胰腺缺血再灌注过程中，胰腺微血管发生痉挛从而导致微循环障碍，而发生微血管痉挛的主要原因则是氧自由基产生增加8，9和内源性NO产生受到抑制。因而预防性地给予NO可以松弛血管内皮细胞改善微血管痉挛，同时NO还可以调节微血管通透性和胰腺

15、血流24，减缓胰腺缺血再灌注损伤，进一步减少氧自由基的产生，减轻胰腺微循环的损伤，另外NO还抑制血小板在内皮细胞粘附与聚集，从而改善血液流变学的异常。SNP作为NO的一种供体，在体内能自发释放NO，发挥NO效应，因而与对照组相比，SNP组胰腺的Na-K-ATP酶活性和Ca2-ATP酶活性均增高。L-NAME是一种一氧化氮合酶抑制剂，抑制体内NO的产生，在胰腺缺血再灌注期间给予该物质，将进一步加重胰腺的损伤，因而与对照组相比，L-NAME组胰腺的Na-K-ATP酶活性和Ca2-ATP酶活性均降低；与SNP组相比，该组两种酶活性则显著降低。综上所述，SNP作为NO供体，可以增加缺血胰腺组织Na-K

16、-ATP酶和Ca2-ATP酶活性，起到胰腺保护作用。参考文献1，Furchgott RFThe discovery of endothelium-dependent relaxationCirculation，1993，87（Suppl）：32，Molero X，Guarner F，Salas A，et alNitric oxide modulates pancreatic basal secretion and response to cerulin in the rat：effect in caute pancreatitisGastroenterology，1995，108：18853，

17、Moncada S Higgs AThe L-arginine-nitric oxide pathwayN Engl J Med，1993，329：20024，Schemidt HHHW，Warner TD， Ishii K，et alInsulin secretion from pancreatic -cells caused by L-arginine-derived nitrogen oxidesScience，1992，255：7215，李席如，何泽生，吴金生，等门脉高压大鼠门静脉及周围血NO水平观察新消化病学杂志，1997，5：3516，Uyama O，Shiratsuki N，Matsuuyama T，et alProtective effects of superoxide dismutase on acute reperfusion injury of gerbil brainFree Radical Bio Med，1990，3：2657，成同怡Na，K-ATPase的结构和功能国外医学分子生物学分册，1990，12：568，Nonaka A，Manabe T，Tobe TEffect of new synthetic ascorbic ac