蛋白质组学研究中的样品制备

1、收稿日期:2006-04-22作者简介:张颖君(1977-,男,河北固安人,硕士,主要从事农作物生物技术研究。蛋白质组学研究中的样品制备张颖君1,高慧敏2,李辉1,刘茜1(11河北省农林科学院粮油作物研究所,河北石家庄050031;2.河北省农林科学院经济作物研究所,河北石家庄050051摘要:蛋白质组学是在后基因组时代出现的一个新的研究领域,它是对机体、组织或细胞的全部蛋白质的表达和功能模式进行研究。由于蛋白质组的复杂性,大大增加了我们研究的难度。本文综述了蛋白质组研究中的样品制备方法。关键词:蛋白质组;样品制备中图分类号:Q51文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2006增刊-0

2、007-04The Sample Preparation in Proteomics StudiesZHANG Y ing 2jun 1,G AO Hui 2min 2,LI Hui 1,LI U Qian 1(1.Institute of Cereal and Oil Crops ,Hebei Academy of Agriculture and F orestry Sciences ,Shijiazhuang050031,China ;2.Cash and Crops Institue of Agriculture ,HebeiAcademy of Agriculture and F or

3、estry Sciences ,Shijiazhuang050051,China Abstract :Proteomics is a new research field appeared in post genome era ,which studies all the protein expressions and function m odels of organism ,tissues or cells.Proteome is very com plex ,which make our research m ore difficult.The paper summarizes the

4、sam ple preparation in proteomics studies.K ey w ords :Proteome ;Sam ple preparation在人类基因组计划完成之后,科学家们发现人类遗传密码的破译并没有像预测的那样能够揭开人类自身的终极奥秘,现在获得的基因组知识还不能告诉我们基因组是如何决定一个人的个体特征以及它们编码的蛋白质到底在人体内起什么样的作用和如何起作用1,这些问题只有依赖于蛋白质组学的深入研究才能给出最终的答案。蛋白质组(Pro 2teome 这一概念是澳大利亚学者Wilkins 和Williams 等人2于1994年提出的。随着蛋白质组的提出,蛋白质组

5、学(Proteomics 3也自然而然地孕育产生。一般认为它是研究特定时间或特定条件下这些蛋白质表达情况的科学4,是在整体水平上研究蛋白质组成与调控规律的科学5。由于生物体内的蛋白质的复杂性,大大增加了蛋白质样品制备的难度。蛋白质的表达具有时间和空间的特殊性,由于mRNA 的自身剪切、拼接、翻译修饰和翻译后修饰的大量存在,使其翻译产物蛋白质的数量可能是基因数量的数十倍,甚至百倍以上6。如简单的真核生物酵母为例,其基因组编码蛋白质为6145个7,人类基因组约含2800040000个编码基因8,其表达的蛋白质可能达十几万。而且蛋白质在不同的细胞、组织、器官、体液中以及不同时段的表达千差万别,且动态

6、范围宽9。1蛋白质样品制备的基本原则样品制备是蛋白质组研究的第1步,它直接影响后期的研究结果。样品来源不同,制备方法也会有所不同,但都需遵循以下几个基本原则10:尽可能采用简单方法进行样品处理,以避免蛋白丢失;细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解;尽可能地提高样品的溶解度,并保持在整个电泳过程中蛋白质的溶解状态; 防止溶液介质中对蛋白质的华北农学报2006,21(增刊:7210人为修饰;破坏蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用,以产生独立的多肽链;有的研究中必须保持蛋白质的活性;去除非蛋白杂质。2样品的分级处理如果组织中只有一类蛋白质是有意义的,那么在样品制备过程中进行分级分离则是必需的

7、。样品分级主要是根据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级的。样品分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测率,还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。如对那些定位于细胞核、线粒体或高尔基体等细胞器的蛋白质,我们可以应用超速离心的方法富集;对那疏水性强的蛋白质我们通常采用分级提取的方法11。还有对临床组织样本进行研究时,临床样本往往是各种细胞或组织混杂,而且状态不一。如肿瘤组织中,发生癌变的往往是上皮类细胞,而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。为了解决这个问题,一种称为激光捕获微解剖(Laser Capture Microdissection, LC M的技术被应用于

8、分离癌变上皮类细胞,取得了很好的效果12。3适宜的选择样品制备方法3.1根据研究的不同目的选择制备方法当进行样品制备时,很重要的一点是明确其研究目的。研究目的是获得尽可能多的蛋白,还是仅获得所感兴趣的某些蛋白;是要求全蛋白表达谱还是可重复的清晰图谱;是需要让蛋白变性后进行二维电泳还是需要蛋白质保持活性。目的不同,提取液的成分就不同,如更注重保持蛋白质的活性,则需用P BS或T ris2HCl等缓冲液;而要进行二维电泳时,提取液往往是由强变性剂等成分构成的。3.2根据蛋白质的不同特性选择制备方法由于蛋白质种类繁多,不同的蛋白质由于结构和组成的差异,其溶解度也各不相同。根据蛋白质的溶解特性,同时可

9、选择不同的溶剂提取。3.3不同组织蛋白质的提取方法外在膜蛋白为水溶性蛋白,靠离子键或其他较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合,因此外在膜蛋白的提取较容易,只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来,膜结构并不被破坏。而内在膜蛋白与膜结合非常紧密,且水溶性不好,使用分级抽提方法获得的膜蛋白中只有很少一部分是具备多跨膜区的整和膜蛋白,一般讲只有用去污剂(Detergent使膜解后才可分离出来。膜蛋白的提取方法一般为: 其非极性尾可插于脂膜而结合高8华北农学报21卷分子量蛋白质而极性头部为强阴离子性使S DS2蛋白质复合物呈高水溶性13。并且,在设计膜蛋白溶解方案时,还必须考虑某一去

10、污剂的特殊性质,如triton X2100在280nm处有吸收,如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关,就应避免使用这类去污剂。4蛋白质的沉淀蛋白质沉淀技术现在被广泛用于蛋白标本的预处理纯化,它可以除去样品中的盐离子、小分子、离子去污剂、核酸、多糖、脂类和酚类杂质,可以富集低浓度蛋白质。如果蛋白聚集和杂质难以去除,则沉淀清除步骤是必需的。常用的蛋白质沉淀方法有硫酸铵沉淀(盐析、T C A沉淀(三氯醋酸沉淀、丙酮沉淀法等。参考文献:1Venter J C,Adams M D,Myers E W,et al.The Sequenceof the Human G enomeJ.Science,2

11、001,291:1304-1351.2Wasinner V C,C ordwell S J,Cerpa P A,et al.Progresswith gene product mapping of the M ollicutes:MycoplasmagenitaliumJ.E lectrophoresis,1995,16:1090-1094. 3D ove A.Proteomics:translation genomics into products?J.Natrure Biotechnal,1999,17(3:233-236.4Van Wijk KJ.Challenges and prosp

12、ects of plant proteomicsJ.Plant Physiol,2001,126:501.5张鹭.蛋白质组学及其技术体系简介J.吉林特产高等专科学校学报,2004,13(2:31-34.6Quadroni M,James P.Proteomics and antomationJ.E lec2trophoresis,1999,20:664.7H odges P E,McK ee A H Z,Davis B P,et al.The yeastProteome Database:a m odel for the organization and presenta2tion of ge

13、nome2wide functional dataJ.Nuceic Acids Re2search,1999,27(1:69-73.8K lose J.Protein mapping by combined is oelectric focusingand electrophoresis of m ouse tissues.Anovel approach totesting for induced point mutations in mammalsJ.Human2genetic,1975,26:231-243.9Wang H,Hanash S J.Multi-dimensional liqu

14、id phase basedseparations in proteomicsJ.Chromatogr B,2003,787:11-18.10陈主初,梁宋平.肿瘤蛋白质组学M.湖南:湖南科增刊张颖君等:蛋白质组学研究中的样品制备9技出版社,2002.11Murayama K.One stepsubcel1ular fractionation of rat livertissue using a Nycodenz density gradient prepared by freez2ing2thawing and tw o2dimensional s odium doecyl sulfate e

15、lec2trophoresis profiles of the mail fraction of organellesJ.E lectrophoresis,2001,22:2872-2880.12Emmert2Buck M R.Laser capture microdissectionJ.Sci2ence,1996,274:998-1001.13曾亮,曹亚.亚细胞蛋白质组学J.生命的化学,2001,21(4:261-264.14Sylwia Wasiak.Enthoprotin:a novel clathrin2ass ociatedprotein identified through sub

16、cellular proteomicsJ.JC B,2002,158:855-862.15Catherine Navarre.Subproteomic:Identification of plasmamembrane proteins from the yeastJ.Saccharomyces Cere2visiae Proteomics,2002,2:1706-1714.16K ennedy S.Proteomic profiling from human sam ples:thebody fluid altemativeJ.T oxicol Lett,2001,120(1-3:379-38

17、4.17G eorniou I I M,Rice G E,Baker M S.Proteomic analysisof human plasma:failure of centrifugal ultrafiltration to re2m ove albumin and other high m olecular weight proteinsJ.Proteomics,2001,1(12:1503-1506.18Davidss on P,Pauls on L,Hesse C,et al.Proteome studiesof human cerebrospinal fluid and brain

18、 tissue using a prepar2ative tw o2dimensional electrophoresis approach prior to massspectrometryJ.Proteomics,2001,1(3:444-452. 19Herbert B,Righetti P G.A tuminn point in proteome analy2sis:sam ple prefractionation via multicom partment electrolvz2ers with is oelectric membranesJ.E lectrphoresis,2000,21(17:3639-3948.