盐酸法舒地尔对大鼠慢性低灌性脑缺血所致学习记忆障碍的改善作用

1、盐酸法舒地尔对大鼠慢性低灌性脑缺血所致学习记忆障碍的改善作用黄琳1,2 郭莲军1 李玉珍2（1 北京大学人民医院，北京 100044；2 华中科技大学同济医学院基础医学院药理学系，武汉 430030）摘要 目的 探讨Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔对大鼠慢性低灌性脑缺血损伤的影响。方法 永久性结扎大鼠双侧颈总动脉制作大鼠慢性低灌性脑缺血损伤模型。运用Morris 水迷宫检测各组大鼠空间学习记忆能力；运用在体电生理技术记录各组大鼠海马CA3区群峰电位，给予高频刺激后观察诱发长时程增强(Long-Time Potentiation, LTP)的情况；免疫组化、Western blot技术分析nNOS的

2、表达。结果 Morris 水迷宫检测发现模型组大鼠学习记忆能力受损，与假手术组比较逃避潜伏期延长、空间辨别能力下降；在体电生理记录中模型组大鼠LTP诱发困难；模型组大鼠皮层和海马部位nNOS表达均减少。给予盐酸法舒地尔能改善脑缺血所致的大鼠学习记忆障碍，提高LTP诱导率和幅值，增加nNOS的表达。结论 盐酸法舒地尔可以改善慢性低灌性脑缺血所致的学习记忆能力损害、突触传递功能障碍和神经元损伤，其可能的作用机制为增加nNOS的表达。关键词 盐酸法舒地尔；Rho激酶；慢性脑缺血；Morris水迷宫；长时程增强（LTP）；nNOS小G蛋白Rho参与调节多种细胞功能，如平滑肌细胞的收缩、细胞骨架的重塑、

3、细胞粘附和移动、胞质分裂、基因表达等1。Rho激酶为Rho特征性的效应器。目前，Rho/Rho激酶途径在细胞水平的功能和信号转导已被广泛研究，然而，有关该信号通路在体水平的报道则很匮乏。盐酸法舒地尔（hydroxy fasudil, HF），一种Rho激酶特异性抑制剂，是研究Rho/Rho激酶信号通路非常有效的工具药2。该信号通路可以调节平滑肌收缩的最终阶段肌球蛋白轻链的磷酸化水平，与血管痉挛3、动脉粥样硬化4和高血压5等疾病的发生均密切相关。我们前期的实验也表明HF可缓解及预防狗迟发性脑血管痉挛，改善狗迟发性脑血管痉挛模型的大脑皮质血流，选择性地增加脑血流量6。然而，有关该通路在脑缺血神经元

4、损伤方面的报道很少。Rho/Rho激酶信号通路与神经细胞的生长和功能活动是密切相关的。在两种短暂性脑缺血动物模型小鼠大脑中动脉栓塞模型7和大鼠脑微血栓模型8 中，法舒地尔或盐酸法舒地尔可显著改善神经功能并减少脑梗死体积。Lehmann等报道C3毒素抑制Rho 从而促进神经轴突生长9。p160ROCK抑制剂Y-27632促进皮质脊髓束损伤大鼠的神经轴突生长，加快其运动功能的恢复10。因此，Rho/Rho激酶信号通路在神经损伤的病理生理过程中也占有重要地位11。目前，有关Rho/Rho激酶在慢性脑缺血所致神经损伤的研究尚很少见。有研究指出：双侧颈总动脉永久性结扎致慢性低灌性脑缺血动物模型中，大鼠前

5、脑区局部脑血流量和葡萄糖利用率均下降，而Rho激酶抑制剂HA1077可改善这些变化12。然而，Rho/Rho激酶信号通路是否参与慢性脑缺血所致认知功能障碍和神经元损伤？本实验中，我们采用永久性结扎双侧颈总动脉方法制作慢性低灌性脑缺血模型，观察长期给予盐酸法舒地尔对模型大鼠学习记忆能力和突触传递功能的影响。此外，我们还探讨了药物发挥作用的可能机制。 作者简介：黄琳(1982-)，女，药剂师，Tel: ，E-mail: linhuang6211 材料和方法1.1 实验动物雄性Sprague-Dawley大鼠，体重180220g，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。大鼠随机分笼饲养，维持室温20

6、22，自由摄食与饮水，自然光照节律，每天提供足量的食物和水。1.2 主要药品和试剂盐酸法舒地尔(hydroxy fasudil，HF)，白色粉剂，纯度>98%，Tocris Cookson Ltd. (Britol, UK)公司生产，批号040311，临用前用生理盐水溶解并稀释至所需浓度，注意避光；尼莫地平（Nimodipine）针剂，德国拜耳制药公司生产；兔抗鼠nNOS抗体购自Santa Cruz Biotechnology；即用型SABC试剂盒及二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司； PMSF、钒酸钠、Aprotinin、

7、Pepstatin和Leupeptin均购自美国Sigma公司，ECL购自美国Pierce Biotechnology。1.3 主要仪器水迷宫检测仪器及软件分析系统：EthoVision, Noldus Information Technology BV, Wageningen, The Netherlands；SN-3型脑立体定位仪：日本Tokyo Narishige公司产品；SEN-7203电子刺激器：日本NIHON KOHDEN公司产品；SS-104J隔离器： 日本NIHON KOHDEN公司产品；SMUP-PC生物信号处理系统软件：上海嘉龙教仪厂产品；低温高速TGL台式高速冷冻离心机：

8、湖南仪器仪表总厂离心机厂； DYY-8C型电泳仪：北京六一设备厂生产。1.4 动物模型制备参考Ni等方法13，永久性结扎大鼠双侧颈总动脉建立大鼠慢性低灌性脑缺血损伤模型（2VO）。大鼠用10水合氯醛0.35ml/100g腹腔内注射麻醉，仰卧位固定，颈部去毛，强力碘消毒，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，并套以“0”号线，分别结扎双侧颈总动脉的远近端，并从中间剪断，以确保阻断颈总动脉血流。缝合后腹腔注射生理盐水45ml，放回笼中饲养；假手术组除不结扎、不剪断双侧颈总动脉外，其余过程与手术组相同。术中保持大鼠肛温36.537.5。各组大鼠同条件饲养，在相同时间点作各种检测。1.5 实验分组与给药Sp

9、rague-Dawley大鼠随机分为五组：假手术组；脑缺血模型组；HF低剂量治疗组：2VO + HF 1 mg/kg；HF高剂量治疗组：2VO + HF 10 mg/kg；尼莫地平治疗组：2VO + Nimo 0.028 mg/kg。术后第一天开始腹腔注射给药，每天一次，持续30天。1.6 大鼠空间学习和记忆能力检测利用Morris水迷宫对各组动物学习记忆能力进行检测。各组均于造模30天后开始进行。测试程序包括：1. 定位航行实验；2. 空间探索实验14。数据由水迷宫统计软件获得，以均数±标准差(± s)表示，各组数据用SPSS12.0软件处理，逃离潜伏期的组间差异用双因素

10、方差分析(TWO-ANOVA)进行检验，探索性实验采用单因素方差分析(ONE-ANOVA)结合Duancans检验。P<0.05具有显著性统计学差异。1.7 在体电生理测试 腹腔注射20%乌拉坦1.2g/kg麻醉，动物俯卧，头部固定于脑立体定位仪上，根据大鼠脑立体定位图谱5定位，通过恒温水循环系统使体温维持在37，以颅骨表面前囟为立体定位参照零点。施行局部开颅术。参照Bliss等方法将镍铬合金丝(=140m)制作的双极刺激电极(尖端裸露，其余部分互相绝缘，外覆聚四氟乙烯绝缘层，两电极间距离为0.5 mm)置于穿通纤维(PP)处(AP6.66.9mm，L或R4.34.4mm，H34mm)，

11、记录电极(单极)置于(AP3.33.5mm，L或R3.33.5mm)，记录电极深度以记录到最大锋电位为准。采用电子刺激器经刺激隔离器给予刺激，测试刺激参数为频率0.5Hz，波宽150s，强度0.6mA，高频刺激(条件刺激)为频率500Hz，强度0.6mA，4串，每串50脉冲，间隙2s。引起PS幅度明显升高，诱导出LTP。只记录诱发电位时则不给予高频刺激（High Frequency Stimulation，HFS）。整个实验过程中用生理盐水湿润软脑膜表面15, 16。测出的PS幅值(mV)，以高频刺激前的PS幅值均值作为基础水平，再分别计算出高频刺激后60min内各观察时刻的PS(mV)

12、47;高频前基础水平PS(mV)×100%，高频刺激后PS水平同刺激前水平比较大于120%为LTP诱导成功。数据以均数±标准差（± s）表示。各组数据用SPSS12.0软件处理，不同组同一时间点或相同组不同时间点PS相对幅值比较采用单因素方差分析(ONE-ANOVA)及Fisher LSD test，P<0.05具有显著性统计学差异。1.8免疫组织化学检测腹腔注射20%乌拉坦1.2g/kg麻醉，于3040min内从左心室快速依次灌注生理盐水100150ml，4%多聚甲醛500ml (4)迅速取脑，置4的同样的固定液中过夜，经上行、二甲苯透明后石蜡包埋。自前囟

13、后2.0 cm处以5 um的厚度行连续冠状切片。 石蜡切片经透明、下行；封闭血清37 30min，勿洗；单克隆兔抗大鼠nNOS（1：150），置湿盒内室温过夜；次日将湿盒置37温箱2h；辣根过氧化物酶标记羊抗兔的抗体，371h；SABC，371h；随后DAB显色510min，镜下观察，适时终止反应；苏木素复染；脱水；透明，树胶封片。所有切片均在相同条件下完成免疫组化反应，对照试验切片不加一抗以PBS替代，其余步骤相同，结果为阴性。每步之间用0.1mol·L-1PBS（pH7.4）洗3次，每次5min。1.9 Western blot将样品与3×上样缓冲液混合（体积比2：1）

14、，煮沸10min，于10SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离；蛋白湿转入硝酸纤维膜上；经5%牛奶（溶于0.02M TBS）封闭60 min；4%BSA封闭5 min；一抗用1%BSA稀释，nNOS 1：1000， 4°C，18h；0.02M TBS 洗膜，10分钟×3次；辣根过氧化物酶标记的二抗，1：3000，37°C孵育1 h；0.02M TBS 洗膜，10分钟×3次；ECL显色，X光胶片曝光并洗片。 采用Smart-View 2001 生物电泳图象分析系统对Western blot显示的免疫反应阳性条带进行光密度测定，分别以目的条带/GAPDH条带的光

15、密度的比值代表目的产物量/GAPDH产物量的相对水平。实验结果以均数±标准差（± s）表示。各组数据用SPSS12.0软件处理，采用单因素方差分析(ONE-ANOVA)结合Duancans检验。P<0.05具有显著性统计学差异。2 结果2.1 盐酸法舒地尔对大鼠慢性脑缺血模型所致认知功能障碍的影响各组动物寻找平台逃避潜伏期的动态变化 实验过程中可见大鼠在第一轮训练中，各组找到平台时间均较长，从第二轮开始，随着训练次数增加，逃避潜伏期总趋势不断缩短。学习训练结束时，假手术组、脑缺血模型组、盐酸法舒地尔低剂量组、高剂量组和阳性药物对照组逃避潜伏期分别为14.42s、80.

16、38s、18.14s、17.14s、20.85s。模型组与假手术组比较逃避潜伏期明显延长（P<0.01）；低剂量组、高剂量组、尼莫地平治疗组与模型组比较逃避潜伏期均有显著性缩短（P<0.05），但HF低、高剂量组和尼莫地平组三个给药组之间并无统计学差异（P>0.05）。见Fig.1A。 空间探索实验结果 探索过程中可观察到假手术组大鼠主要在原来平台所在象限进行来回穿梭，其次较多地在原平台象限相邻的左右两侧象限寻找，很少跨至对侧象限；而模型组在原来平台所在象限穿梭时间明显少于假手术组（P<0.05），盐酸法舒地尔和尼莫地平均可显著增加大鼠在靶象限中的游泳时间（P<0

17、.05）。假手术组、模型组、盐酸法舒地尔低剂量组、高剂量组和阳性药物对照组在原平台所在象限探索时间占探索总时间百分比分别为(39.89±5.68)%、（20.17±7.87）%、(32.00±4.00)%、（33.70±4.77）%、（33.80±4.80）%。见Fig.1B。2.2 盐酸法舒地尔对2VO大鼠海马突触传递功能的影响假手术组、模型组、低剂量组、高剂量组和阳性药物对照组大鼠强直刺激PP纤维后60 min内海马CA3区PS幅值变化（Fig.2A）。结果发现，强直刺激PP纤维可诱导CA3区LTP形成，其后60 min内PS相对幅值持续升

18、高并稳定在基础幅值的（196.39 ± 9.43）%水平，显著高于高频刺激前（100.00±4.11）(P < 0.01)；模型组大鼠LTP诱导明显被抑制，其PS相对幅值在各时间点均显著低于LTP组(P < 0.05)， 60 min内PS相对幅值平均为（124.49 ± 1.12）%；与模型组相比，低剂量组、高剂量组和阳性药物对照组大鼠LTP诱导情况均得以改善，其PS相对幅值在各时间点均显著高于模型组(P < 0.05)。见Fig.2B和Fig.2C。2.3 盐酸法舒地尔对nNOS 表达的影响 1) 免疫组化结果显示：经DAB染色后光镜下nNO

19、S 阳性反应产物呈深棕色，大鼠脑内各部位都有nNOS 表达, 以大脑皮质、海马CA1区表达最丰富。假手术组中，可见胞浆内nNOS 表达，细胞形态完整；与假手术组相比，模型组胞浆nNOS 阳性染色明显减少；治疗组胞浆nNOS 阳性染色增强，阳性对照药作用不如HF。见Fig.3A。2) 免疫印迹结果显示：Western blot结果与免疫组化结果一致。在缺血脑损伤组中，皮层和海马nNOS 阳性反应产物显著降低(P < 0.05)。与之比较，HF及阳性药治疗均可上调其表达(P < 0.05)。见Fig.3B。3 讨论我们的实验结果显示永久性结扎双侧颈总动脉致慢性缺血30天后，大鼠皮层和海

20、马组织nNOS蛋白表达水平均下降。长期给予Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔能减弱这些变化，并改善脑缺血所致的大鼠学习记忆能力损害，提高LTP诱导率和幅值，减少神经元丢失。行为学检测发现，术后30天模型组出现明显的学习记忆功能障碍，表现为逃离潜伏期的延长和在目标象限中游泳时间的缩短，表明慢性脑缺血可以导致学习记忆障碍和神经元损伤，与文献报道一致10。有意义的是，腹腔注射Rho抑制剂盐酸法舒地尔，一天一次，连续30天后，脑缺血损伤的SD大鼠在习得性试验及探索性试验中，学习能力和记忆保持能力均明显提高。提示盐酸法舒地尔对大鼠慢性低灌所引起的认知功能障碍和神经元死亡具有保护作用。长时程增强（long-te

21、rm potentiation, LTP）是高频刺激引起的神经特征的稳定变化，是反应学习记忆过程中神经元生理活动的一个重要的客观指标17。以前研究18及我们的近期研究19亦证实刺激穿通纤维可激活CA3区锥体细胞并诱发特征性场电位。因此，刺激穿通通路记录CA3区场电位是研究海马信息处理机制及探究药物干预作用的良好途径。体内外实验表明缺氧或缺氧缺糖均可使ATP产生减少，导致突触传递的抑制，并可影响神经递质的合成、动员和释放，特别是在高频电刺激后，可显著减少小泡内ATP和递质的储存，从而影响LTP的诱导和维持20。本实验发现，模型组大鼠Perforant path-CA3通路处LTP诱发困难，其诱导

22、率和幅值均低于假手术组，而盐酸法舒地尔治疗组LTP诱导情况得以显著改善，表明慢性脑缺血抑制LTP，盐酸法舒地尔可以促进海马突触传递功能。LTP诱导过程中，海马锥体神经细胞的树突棘和分支发生动态改变，Rho/Rho激酶信号通路对这些结构的产生和维持密切相关21。这些电生理学实验结果与我们在行为学实验中的发现相一致，共同表明了Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔对大鼠慢性低灌性脑缺血损伤具有保护作用。虽然脑内NO的过量释放对其周围神经元具有毒性作用，但NO也是一种重要的血管、神经活性物质。在正常生理情况下nNOS催化产生的NO作为中枢神经系统细胞间信使分子，在学习记忆机制中具有重要作用。NO在突触后产生并

23、弥散出神经元，逆向运行至突触前以及周围相关神经元，透过细胞膜活化鸟苷酸环化酶，使cGMP水平升高，促进神经递质（如谷氨酸）释放，谷氨酸作用于突触后NMDA及非NMDA受体，Ca2+ 内流进入突触后与钙调蛋白一起激活NOS，诱发产生NO，诱导和维持长时程增强（LTP）过程，因而NO作为逆行信使介导LTP的形成22。本研究中，慢性低灌注缺血性脑损伤30天后大鼠皮层和海马nNOS表达比假手术组显著降低，此结果与以往研究结果一致。慢性脑缺血后期，脑血流严重减少，神经元及血管内皮严重受损，nNOS 表达持续减少，NO含量显著低于正常水平，可以加重脑缺血的症状。与模型组比较，盐酸法舒地尔治疗组明显提高 n

24、NOS 的表达，增加NO的含量。此时，上调nNOS的表达促进NO的合成对脑组织有保护作用。综上所述，Rho/Rho激酶信号通路与慢性脑缺血损伤的病理生理学过程密切相关。长期给予盐酸法舒地尔治疗可以改善模型大鼠空间学习记忆能力损害，提高LTP诱导率和幅值，减少神经元丢失，其神经保护作用可能通过增加nNOS的表达而实现。参考文献1. Hiroaki Shimokawa, Akira Takeshita. Rho-Kinase is an important therapeutic target in cardiovascular medicine. J Arterioscler Thromb Va

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38、ficit and Neuronal Damage in RatsLin Huang1, Lian-jun Guo2. Li Yu-zhen11 Department of Pharmacy, Peking University Peoples Hospital, Beijing, 100044, P.R. China.2 Department of Pharmacology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, P.R. ChinaCorrespondence

39、 to Lin Huang, Tel E-mail:ABSTRACTOBJECTIVE: To study the effects of hydroxyl fasudil, a Rho-kinase inhibitor, on chronic cerebral hypoperfusion induced deficits in rats. METHODS: Chronic cerebral hypoperfusion in rats was performed by permanent bilateral ligation of the common carotid

40、 arteries. Morris water maze was used to measure spatial memory performance. Electrophysiological equipments were used to record long-term potentiation (LTP). The expression of nNOS was assayed by immunohistochemistry and Western blot. RESULTS: Chronic cerebral hypoperfusion in rats resulted in spat

41、ial memory impairments shown by longer escape latency and shorter time spent in the target quadrant. These behavioral dysfunctions were accompanied with reduction of LTP, decreases in nNOS protein expression. Long-term administration of hydroxyl fasudil markedly improved the spatial memory impairmen

42、t, prevented the reduction of LTP, attenuated neuronal damage, enhanced the expression of nNOS. CONCLUSION: Long-term hydroxyl fasudil treatment provides neuroprotective effects on memory deficit and neuronal damage after ischemia, which may associated with enhancement of nNOS expression. Moreover,

43、rho kinase plays a critical role in the pathogenesis of chronic ischemic cerebral damage.KEY WORDS Hydroxyl fasudil; Rho-kinase; chronic cerebral ischemia; Morris water maze; LTP; nNOS(A)(B)Fig. 1. Effect of hydroxy fasudil on water maze performance deficits 30 days after 2VO in rats. (A) Each point

44、 represents the mean of escape latency results from the start point onto the hidden platform for each day. (B) The bar graph shows percentage of the time spent in the target quadrant (Q3) in 180 s probe trial (no platform). Following cerebral ischemia, the rats were given intraperitoneal injection o

45、f saline or hydroxy fasudil 1 mg/kg or 10 mg/kg, once daily for 30 days. The sham-operated group was given only saline. For A and B, each data point represents mean ± SD, n=7-10; aP <0.05 and aaP < 0.01 when compared to sham-operated group; bP <0.05 and bbP < 0.01 compared to ischem

46、ia group.图1 盐酸法舒地尔对2VO术后30天大鼠水迷宫成绩的影响。（A）逃避潜伏期随时间变化曲线图；（B）各组动物在原平台所在象限探索时间占探索总时间的百分比。(A) (B)(C)Fig. 2. In vivo effect of hydroxy fasudil on LTP in the perforant path-CA3 synapses of rats with chronic hypoperfusion after 2VO. (A) PS amplitude was measured before (left) and after (right) tetanus stimu

47、lation. LTP was inhibited in the ischemia group as compared to sham-operated group. Hydroxy fasudil at 10 mg/kg abolished the inhibition. (B) The linear graph illustrates the relative PS amplitude alteration at different time point within the 60 min after tetanus stimulation. (C) PS amplitudes expressed as the ratios of PS height of pre-tetanus divided by post-tetanus times 100% (mean ±SD, n=5-7). Note: significantly higher levels of PS amplitude in hydroxy fasu