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1、本科毕业论文（设计）题目： 高效液相色谱法分离与测定 柴胡中的柴胡皂甙 a 姓 名： 学号： 学 院： 专业： 指导教师： 职称： 评 阅 人： 职称： 2005 年 6 月高效液相色谱法分离与测定柴胡中的柴胡皂甙学生：导师：摘要：中药柴胡为伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根，具有解热镇痛、利胆保肝等作用。柴胡中的柴胡皂甙a和柴胡皂甙d为其有效成分。本文采用反相高效液相色谱法对北柴胡中的柴胡皂甙a进行了分离和测定。选择出分离的最佳条件：流动相为90%乙腈+10%水，流速为0.8mLmin-1，检测波长为208nm，在0.051.50mgmL-1范围内柴胡皂甙a的含量与峰面积线性关系良好，回归方程

2、为：Y=2258428X+186676，相关系数R=0.9993，检出限为2.3ngmL-1，回收率为100.5%,分离效果良好。关键词：柴胡，柴胡皂甙a，HPLC，分离，测定Determination of the Saikosaponin a in BupleurumRoot by HPLCCandidate:Advisor:Abstract:Chair-hu, the root of Bupleurum Chinense DC or Bupleurum scorzonerifolium Willd, is a popular traditional Chinese drug. It ha

3、s been used in medical treatment for over 2000 years and has been primarily used to treat fever and chill in turn. In this paper, Saikosaponin a and saikosaponin d, which were verified as bioactive compounds in chair-hu, are investigated using reverse phase high-performance liquid chromatography (RP

4、-HPLC) with UV detector. The best conditions of the experiment were chosen The components of mobile phase are 90% acetonitrile and 10% water, while its flow velocity is 0.8 mLmin-1. The detecting wavelength is 208nm. A best linearity of signal and the concentration of saikosaponin a standard substan

5、ce was obtained when the concentration of saikosaponin a,is between 0.05mgmL-1 and 1.50 mgmL-1, the regress equation is Y=2258428X+186676, and the correlation coefficient is 0.9993. The determination limit of Saikosaponin a is 2.3ng mL-1, the recovery is 100.5%. Satisfactory results were obtained in

6、 the sample determination.Key words: Chair-hu, saikosaponin a, bioactive compounds, HPLC目录第一章 前言1§1.1 中药的起源与发展1§1.2 中药有效成分及其分离纯化的研究现状1§1.3 本文的研究对象柴胡2 柴胡简介2柴胡皂甙的化学性质2柴胡皂甙的药学作用3柴胡皂甙的研究现状3本文所做工作3第二章 实验部分5§2.1 实验原理5§2.2 实验方法6仪器及试剂6实验步骤7色谱条件7第三章 结果与讨论8§3.1 检测波长的选择8§3.2

7、色谱条件的选择8流速对分离效果的影响8乙腈比例的选择10§3.3 标准曲线及线性关系考察11§3.4 精密度实验12§3.5 回收率实验12§3.6 样品分析12第四章 结论14致谢15参考文献162005.5 中国地质大学学士学位论文 15第一章 前言§1.1 中药的起源与发展中医药源远流长，它的发现与应用经历了长期实践的过程。原始时代，我们的祖先由于采食植物和狩猎，接触并了解到某些植物和动物具有一定的治病作用，经过无数次的试验、观察、口尝身受等，慢慢积累起一些运用中草药的知识。唐代李绩、苏敬等主持编写了最早的一部药典学著作新修本草（又称唐本

8、草），比起1542年欧洲纽伦堡药典来，要早出800余年，对医学的发展作出了重要的贡献。虽然现代医学非常发达，但是中药的药效缓和、副作用少，经过数千年的医学实践证明确实有效。用中医药治病，不是“头痛医头、脚痛医脚”，而是把全身作为一个整体，综合治疗，全面地解决问题，因此具有其特殊性。随着生产力的提高，如今中医药也采用现代科学的理论和方法进行研究，如动物实验、组织病理学观察、药物化学成分分析等。服食中药已不再以煎煮草药为主，而是出现了药片、胶囊、浸膏液、糖浆等剂型，使服食中药变得省时省事、简单方便。目前已经鉴定且有学名的中药已达8千余种，而常用的中药有500多种，包括植物药、动物药和矿物药，其中绝

9、大部分为植物药。近来，随着现代工业的飞速发展，我国的中药生产状况大有改进，截至2004年，中药产值比1979年翻了五番，占医药工业产值的40%以上1。中药制剂工业生产中的重要步骤是中药有效成分的提取和分离，只有将有效成分提取出来并加以纯化，才能对这些化合物的各种性质和功能进行全面研究，这些直接关系到中药制剂的质量、疗效和产量。§1.2 中药有效成分及其分离纯化的研究现状现代研究结果表明，中药的有效成分主要是生物碱、黄酮、苷类、酚类、甾类、蒽酮、木质素、有机酸、氨基酸、多糖、蛋白质、多肽酶、挥发油以及萜类2。至今为止，研究的主要对象集中在生物碱、皂苷、黄酮、多糖、蛋白质类成分上。在中药

10、有效成分的分离方面，有文献记载3.4的分离方法有：（1）系统溶剂分离法 一般是将皂甙总提取物，选用三、四种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步进行提取分离。利用柴胡中各化学成分，在不同极性溶剂中的溶解度进行分离纯化。（2）两相溶剂萃取法 萃取法：两相溶剂提取又简称萃取法，是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。 逆流连续萃取法：是一种连续的两相溶剂萃取法。 逆流分配法：逆流分配法又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法与两相溶剂逆流萃取法原理一致，但加样量一定，并不断在一定容量的两相溶剂中，经多次移位萃取分配而达到混合物的分离。 液滴逆流分配法：液滴

11、逆流分配法又称液滴逆流层析法。为近年来在逆流分配法基础上改进的两相溶剂萃取法。对溶剂系统的选择基本同逆流分配法，但要求能在短时间内分离成两相，并可生成有效的液滴。（）铅盐沉淀法 利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶的铅盐或络盐沉淀，而用于分离中药成分。柴胡皂甙一般用碱式醋酸铅。通常将铅盐沉淀滤出，然后将沉淀悬于水或者稀醇中，通入硫化氢气体或加入硫酸钠等试剂进行脱铅，即可回收提取物。（）盐析法 盐析法是在中草药的水提液中、加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大的杂质分离。常用作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸

12、铵等。（）透析法 透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。（）色谱法 随着色谱理论逐步发展，实验技术也逐步仪器化、自动化和高速化，色谱技术已经成为化学领域一个重要的分离、分析工具。 目前色谱法发展的趋势是与光谱分析相结合。§1.3 本文的研究对象柴胡 柴胡简介中药柴胡为伞形科植物柴胡（北柴胡, Bupleurum Chinense DC）或狭叶柴胡（南柴胡, Bupleurum. scorzonerifolium Willd）的干燥根5。前者主要产于辽宁、甘肃、河北、河南等地，后者主要产于湖北、江苏、四川等地，是常用中药之一。本经

13、记载，“柴胡用于寒热往来，感冒发热，味辛苦，气微寒，芳香疏泄，尤善于疏散少阳半表半里，为治疗寒热往来，胸肋苦满，口苦咽干等少阳症之要药”。据文献记载6，柴胡属约100余种，我国现已经知道有36种，17变种，7变型，品种繁多，质量各异。柴胡作为药用，因为产地和使用地区，不仅使用种类不同，而且使用部位也不同。有些地区使用根类柴胡，有些地区使用全草类柴胡。柴胡中柴胡皂甙a和柴胡皂甙d为有效活性成分7。本实验所用样品为北柴胡，购于武汉中联大药房鲁磨路店，其产地为河北。 柴胡皂甙的化学性质柴胡皂甙为三萜类皂甙，三萜皂甙元是由6个异戊二烯，30个碳原子构成的8。迄今为止,已证明存在的柴胡皂甙有：a、b、c

14、、d、e、f、i、k、m、n、q、s、t，其中柴胡皂甙i、k、m、n、q、s、t为近几年新发现9-13。柴胡皂甙分子量较大，不易结晶，为无色或者乳白色无定形粉末，多数具有苦而辛辣味，其粉末对人体各部分的粘膜有强烈的刺激性，尤以鼻内粘膜最为灵敏，吸入鼻内能引起喷嚏。除此外，还具有吸湿性、发泡性和较弱的溶血性。柴胡皂甙极性较大，易溶于水、热甲醇和乙醇，难溶于丙酮和乙醚。柴胡皂甙在含水丁醇中有较大的溶解度，所以常用正丁醇作为提取柴胡皂甙的溶剂。 柴胡皂甙的药学作用从柴胡的干燥根中提得柴胡总皂甙（1.6%3.8%）14，既往已经报道15.16具有镇静、止痛、解热镇咳、抗炎、保肝、抗肿瘤、降低血压、抑制

15、由组胺和5-羟色胺引起的血管通透性增加等作用。近年来，有文献报道了一些新的进展，现汇总如下：抑制胰蛋白酶 柴胡在临床上用于治疗急性胰腺炎，但其有效成分及治疗作用机制前无报道17。抑制腺苷酸环化酶（AC） 林明栋等首次发现柴胡分离组分CH-5（柴胡粗皂甙）能显著抑制小鼠肝制备AC的活性，在一定浓度范围内有明显量效关系18。柴胡皂甙衍生物具有免疫调节作用19.20。用于治疗肾小球疾病21.22。影响睡眠 现代医学研究证明，柴胡皂甙具有镇静、抗惊厥等中枢抑制作用，临床可用于多种神经系统疾病23.24。1.3.4 柴胡皂甙的研究现状迄今为止，已经证明化学结构的柴胡皂甙共有10种,分别为a、b1、b2、

16、b3、b4、c、d、e、f、t。在以上提及的分离方法中，适合柴胡皂甙的分离的有铅盐沉淀法、色谱法，其中较常用的色谱法有吸附色谱法、分配色谱法、高效液相色谱法。有报道25用硅胶柱层析法、薄层色谱法成功分离出柴胡皂甙a、b、c，但是这些方法存在一定的缺陷，一是分离时间比较长，二是分离效果不理想。1.3.5 本文所做工作本实验采用反相高效液相色谱法对北柴胡中的柴胡皂甙a进行分离与测定，检测器为紫外检测器。以乙腈和水的混合液为流动相，能达到较好的分离效果，做到快速分离，而且峰形较好。标准样品线性和重复性好，RSD（n=9）为1.09% ，检出限为2.3ng.mL-1，回收率为100.5%，结果令人满意

17、。第二章 实验部分§2.1 实验原理高效液相色谱法使混合物中各组分在两相中进行分配，其中一相是不动的固定相，另一相是液体流动相，它推动混合物流过固定相。当液相携带混合物经过固定相时，与固定相发生相互作用。由于各组分的结构性质（如溶解度、极性、蒸汽压、吸附能力）不同，这种相互作用便有强弱差异（组分不同分配系数不同）。因此在同一推动力作用下不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后顺序从装有固定相的柱中流出。分离度是指相邻两组分保留时间之差与两组分基线宽度之和的一半的比值，用Rs表示，若要达到基本分离，一般Rs = 1.0；要达到完全分离，Rs = 1.5。色谱定量分析的依据是在一

18、定的色谱条件下，待测组分I的质量mi或其在流动相中的浓度与检测器响应信号（峰面积Ai或峰高hi）成正比。但因检测器对不同物质的响应值不同，故相同质量的不同物质通过检测器时，产生的峰面积或峰高不等，因而不能直接应用峰面积或峰高计算组分含量，必须测定峰面积或峰高及其对应的校正因子。以峰面积响应信号Ai为例式中fi称为面积校正因子，又称绝对校正因子。在定量分析中，常用相对校正因子式中mi和ms分别为i物质和标准物s的质量，Ai和As分别为对应的峰面积。定量分析方法有：（1）归一化法如果试样中所有组分均能流出色谱柱并显示色谱峰，则可用此法计算组分含量。设试样中共有n个组分，各组分的量分别为m1，m2，

19、mn，则i中组分的百分含量是：归一化法的优点是简便、准确，进样量的多少不影响定量的准确性，操作条件的变动对结果的影响也较小，对多组分的测定尤其显得方便。缺点是试样中所有的组分必须全部出峰，某些不需定量的组分也需测出其校正因子和峰面积，因此其应用受到一定的限制。（2）内标法当试样中所有组分不能全部出峰，或只要求测定试样中某个和某几个组分时，可用此法。准确称取m(g)试样，加入某纯物质ms(g)作为内标，根据试样和内标物的质量比ms/m及相应的色谱峰面积之比，基于下式可求出组分i的百分含量Wi：   fis、fss为被测组分和内标物的相对重量校正因子。如果以内标物为基

20、准物，此时fss=1，则上式可以简化为（3）外标法（标准曲线法）在一定的色谱操作条件下，用纯物质配制一系列不同浓度的标准样，定量进样，按测得的峰面积对标准系列的浓度作图绘制标准曲线。在相同的条件下定量进样，由所得的峰面积从标准曲线上即可查得待测组分的含量。其优点是操作和计算简便，不需要知道所有组分的相对校正因子。§2.2 实验方法 仪器及试剂UV-210PCS型紫外分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司PE200/785A型高效液相色谱仪，美国Perkin Elmer公司3510EMTH超声清洗器，BANSONIC公司微孔溶剂过滤器，天津津腾过滤器件厂电子分析天平，R200D 德国乙

21、腈，HPLC GREAD，Fair Lawn，New Jersey，USA甲醇，HPLC GREAD，Fair Lawn，New Jersey，USA吡啶，分析纯，沈阳试剂一厂丙酮，分析纯，北京52952化工厂乙醚，分析纯，沈阳试剂一厂正丁醇，分析纯，天津市化学试剂三厂无水乙醇，分析纯，上海振兴化工一厂柴胡皂甙a标准品，上海和杰科技有限公司去离子水2.2.2 实验步骤1. 样品溶液的制备根据柴胡皂甙易溶于水、甲醇、乙醇以及水饱和的正丁醇而不溶于乙醚的性质，选定了柴胡皂甙a提取方法，其流程图如下：乙酸乙酯溶液沉淀（总皂甙）滤液沉淀（粗皂甙）甲醇提取液残留物提取液柴胡根细粉热乙酸乙酯除去油状物3m

22、L乙醇溶解皂甙溶液含5%吡啶的甲醇提取 回收甲醇加水后用水饱和的正丁醇提取 回收正丁醇，加入乙醚，过滤将提取的皂甙溶液，经过0.45mm微孔滤膜过滤，定容至5mL，冷藏保存。2. 标准溶液的制备准确称取柴胡皂甙a标准5.0mg，用乙腈溶解，定容至10mL，冷藏保存。3. 分离与测定将经过0.45mm微孔滤膜过滤的样品溶液，用微量注射器每次取10mL进样。比较谱图，计算柴胡皂甙a的分离度，选出最佳分离条件，然后在选定的条件下作标准曲线，利用外标法计算样品中柴胡皂甙a的含量。2.2.3 色谱条件色谱柱：Supelco-C18柱（5µm, 150×4.6mm, USA）；流速：0

23、.8mL·min-1；流动相：乙腈-水（CH3CN:H2O=90:10）；检测波长：208nm；进样量：10mL；温度：室温。第三章 结果与讨论§3.1 检测波长的选择取配制好的标准溶液，用紫外分光光度计扫描以确定检测波长，吸收曲线如图1所示。在208nm处柴胡皂甙a有较强的吸收，因此选择208nm作为紫外检测波长。图1 柴胡皂甙a的紫外光谱图§3.2 色谱条件的选择 流速对分离效果的影响在流动相比例为90%乙腈+10%水、进样量为10mL时，改变流速（0.61.0mL·min-1），试验了流速对保留时间和分离度的影响，结果见表1和图2。结果表明，流速增

24、大，柴胡皂甙a的保留时间减小，色谱峰难以实现完全分离，分离度变小，且流速过高，柱压上升，影响色谱柱的寿命和性能，流速太低，谱峰扩宽，拖尾严重，保留时间增大，分析时间较长。本文选用流动相的流速为0.8ml·min-1，可以获得良好的分离效果。表1 流速对保留时间和分离度的影响流速（mL·min-1）保留时间（min）分离度0.64.21.670.83.11.501.02.51.09aaabac图2流速对分离度以及保留时间的影响a. 0.6mL·min-1 b. 0.8mL·min-1 c. 1.0mL·min-1 乙腈比例的选择采用乙腈-水为流动

25、相，在流速为0.8mL·min-1、进样量为10mL的条件下，对乙腈比例在80%100%范围内考察了其对保留时间以及分离度的影响，结果见表2和图3。可以看出,柴胡皂甙a的保留时间随乙腈比例的增大而减小。乙腈比例比较小时色谱峰变宽，柴胡皂甙a的保留时间增大，分析时间过长。乙腈比例过大时，保留时间太短，无法获得良好的分离效果。因此，所选流动相的最佳比例为90%乙腈+10%水。表2 乙腈比例对保留时间以及分离度的影响水：乙腈保留时间（min）分离度0：1002.730.8610：903.111.5020：803.871.30aaabac图3 流动相比离对分离度和保留时间的影响a. 100%

26、乙腈 b. 90%乙腈+10%水 c. 80%乙腈+20%水§3.3 标准曲线及线性关系考察准确称取柴胡皂甙a 5.0mg，用乙腈定容至5mL，用1mL移液管分别取配制好的标准溶液0.25mL、0.50mL、0.75mL、1.0mL，然后用乙腈定容到1mL，摇匀。按上述的色谱条件各进样10L。以峰面积对相应浓度（mg·mL-1）作标准曲线。峰面积及对应浓度如表3，标准曲线如图4。表3 标准系列浓度及对应峰面积浓度（mg·mL-1）0.250.500.751.0峰面积725786132674318943252404963图4 标准曲线得到回归方程为：Y=225842

27、8X+186676 (Y:AUFS, X: mg·mL-1)，R=0.9993。§3.4 精密度实验精密吸取标准溶液10mL（0.50mg·mL-1），重复进样9次，测得RSD为1.09（n=9）。按同样方法柴胡皂甙a进行处理，准确吸取样品溶液10mL，重复进样5次，以外标法计算含量。得到柴胡皂甙a的RSD为1.26（n=5）。按实验步骤做全程序空白10份，测得检出限为2.3ng·mL-1。§3.5 回收率实验将北柴胡样品称取0.5003g，按提取方法提取。记录提取液原始峰面积（S0），加标后峰面积（S1），0.50mg·mL-1柴胡

28、皂甙a标准溶液峰面积（S2），计算提取液的加标回收率（R%）、RSD（n=5）。（见表4）。表4柴胡皂甙a加标回收率序号原始峰面积（S0）加标后峰面积（S1）标准溶液峰面积（S2）加标回收率（%）平均回收率(%)相对标准偏差（RSD）1140599325608711326743101.2214059932545297132674399.93140599325629761326743101.1100.51.85%4140599325526731326743100.3514059932544985132674399.8§3.6 样品分析准确称取北柴胡样品0.5000g，按所选的较优的提取

29、条件：浸渍24小时，在50、功率为50%条件下超声20min，对样品进行提取，将提取液经过0.45mm微孔滤膜过滤，然后定容至5mL。精密吸取10mL溶液按前述色谱条件进行测定，重复5次。用外标法，利用其峰面积，根据标准曲线计算样品提取液的浓度以及柴胡中柴胡皂甙a的含量，结果如表5：表5 北柴胡中柴胡皂甙a的分析结果序号样品峰面积浓度(mg·mL-1)含量(%)平均含量(%)相对标准偏差(RSD)113630540.52090.5209213833940.52990.5299313868650.53140.53140.52321.46%413383820.51000.51005137

30、00310.52400.5240第四章 结论本文对中药的研究现状、柴胡皂甙的性质作了概述，并对高效液相色谱在样品分离以及测定时色谱方法进行了研究，可得出如下结论：（1）高效液相色谱作为近30年发展起来的具有高灵敏度、高选择性、高效、快速的分离分析技术，是一种非常有效和普遍适用的药物分析方法，特别是针对成分较为复杂的中药。随着新的高效通用型检测器的发展，其适用性和灵敏度得到显著提高，从而使复杂样品的分析成为可能。另外，高效液相色谱给出的是高分辨率的轮廓图谱，重现性好，操作相对容易.在线检测设备可选性较大。（2）对中药有效成分的研究是为了使中药的疗效得到近代科学理论的阐释，以便更好的掌握药性，保证

31、中医临床处方用药的准确性，提高中药疗效，并从中寻找新药，开辟目前医药学尚未解决的防御疾病的新领域。（3）柴胡作为一种常用中药，分离出其有效成分，有助于进一步对其性质进行研究。通过实验，我们得出的较好的实验条件为：流动相90%乙腈+10%水；检测波长208nm；流速0.8 mL·min-1；进样量为10mL。实验中存在的不足：实验做的不够充分。由于理论知识的不足，对于梯度脱洗进行了一些尝试性试验，却没有从中找到较好的分离条件；由于一些客观原因，本次实验只对北柴胡中的柴胡皂甙a的性质和分离条件进行了一些研究，要对柴胡或者其他中药有深入的了解，后续工作依然很多，还需要大量的实验。致谢参考文

32、献1 郑虎占. 中药现代研究与应用（第四卷）. 北京: 学苑出版社, 1998. 3688.2 吴寿金. 现代草药成分化学. 北京: 中国医药科技出版社, 2001. 12(4): 796.3 杨云. 天然药物化学提取分离手册. 北京: 中国中医药出版社, 2003. 527-528.4 李德江, 付和清. 天然产物分离技术的新进展. 天津化工, 2004, 18(2): 10.5 史青, 聂淑琴, 黄璐琦. 柴胡属植物化学成分及药理研究新进展. 中国实验方剂学杂志, 2002, 8(5): 54.6 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志. 北京: 科学出版社, 1990. 55(1):215.7 李光慧等. 柴胡类药材的柴胡皂甙分析. 植物资源与环境, 1996, 5(3): 59.8 吴立军. 天然药物化学. 北京: 人民卫生出