补阳还五汤及其有效组分和三七总皂苷含药血浆抗血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的作用

1、补阳还五汤及其有效组分和三七总皂苷含药血浆抗血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的作用         11-01-25 10:25:00     作者：李花, 陈刚, 邓常    编辑：studa20【摘要】  目的：研究补阳还五汤及其有效组分和三七总皂苷（total Panax notoginseng saponins，TSPN)含药血浆对血小板衍生生长因子（plateletderived growth factor

2、，PDGF）诱导的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖的影响。方法：采用血浆药理学方法及PDGFBB诱导VSMC增殖模型。以甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测空白血浆对VSMC生长的影响和含药血浆对PDGFBB诱导的VSMC增殖的半数抑制浓度，确定补阳还五汤及其有效组分和三七总皂苷用药浓度。MTT法和流式细胞术检测补阳还五汤及有效组分和TSPN、阿托伐他汀对VSMC增殖活性及细胞周期的影响。结果：PDGFBB剌激后，VSMC增殖活性显著增强，G0/G1期细胞数减少，G2/M期和S期细胞数增多

3、。与PDGFBB剌激组比较，补阳还五汤、有效组分生物碱和苷、TSPN、阿托伐他汀等含药血浆均可抑制PDGFBB诱导的VSMC增殖，增加G0/G1期细胞数，减少G2/M期和S期细胞数。结论：补阳还五汤及其有效组分和TSPN均可抑制PDGFBB诱导的VSMC增殖。生物碱和苷可能为补阳还五汤中抗VSMC增殖的主要药效物质，补阳还五汤及其有效组分生物碱和苷具有与阿托伐他汀、TSPN相似的抗VSMC增殖的作用。 【关键词】  补阳还五汤; 生物碱; 苷; 三七总皂苷; 血浆药理学; 血管平滑肌细胞; 细胞增殖Objective: To explore the effects of plasma

4、 containing Buyang Huanwu Decoction (BYHWD), a compound of traditional Chinese medicine, and its effective components (alkaloids and glycosides) and total Panax notoginseng saponins (TSPN) on vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation induced by plateletderived growth factor (PDGF) in vitro.Me

5、thods: VSMC proliferation was induced by incubating VSMCs with PDGFBB. Effects of different concentrations of blank plasma on the VSMC proliferation and 50% inhibitory concentrations of plasma containing BYHWD, its alkaloids and glycosides, TSPN and atorvastatin were detected by using methyl thiazol

6、yl tetrazolium (MTT) method to determine the concentrations of plasma containing drugs for the following experiments. Then, MTT and flow cytometry methods were used to detect the effects of plasma containing BYHWD, its alkaloids and glycosides, TSPN and atorvastatin on VSMC proliferative activity an

7、d cell cycles.Results: VSMC proliferative activity was enhanced obviously after PDGFBB stimulation. The cell number in G0/G1 phase was decreased and the cell quantity in G2/M and S phases was increased following PDGFBB stimulation. Compared with PDGFBB stimulation group, VSMC proliferation induced b

8、y PDGFBB in plasma containing BYHWD, its alkaloids and glycosides, TSPN and atorvastatin groups was inhibited. In all plasma containing drug components groups, the cell number of G0/G1 phase was higher and the cell quantity of G2/M and S phases was lower than those in the PDGFBB stimulation group.Co

9、nclusion: BYHWD and its alkaloids and glycosides have similar roles of resisting VSMC proliferation to TSPN and atorvastatin. Alkaloids and glycosides may be the major effective substances of antiVSMC proliferation in BYHWD.Keywords: Buyang Huanwu Decoction; alkaloids; glycoside; total Panax notogin

10、seng saponins; plasma pharmacology; vascular smooth muscle cell; cell proliferation血清药理学方法是给动物灌服中药或复方一定时间后，取其血清进行体外实验的一种方法1。尽管血清药理学方法在中药和复方药理研究中有重要的作用，但其局限性也日益受到关注。在制备血清时由于血液凝固等的影响，血清药理学方法并不符合中药在体内的真实过程，含药血清中的“药效物质”可能并不能正确反映中药的有效成分。因而有人提出了用含药血浆进行中药或复方体外实验的“血浆药理学（plasma pharmacology）”方法2，这种方法有可能成为中药药

11、理研究的重要方法之一。    补阳还五汤（Buyang Huanwu Decoction，BYHWD）为中医药治疗脑缺血、缺血性心脏病的有效方剂。我们的研究表明，该方中的生物碱、苷类组分为其主要的有效组分。该方及其有效组分生物碱和苷可抑制大鼠主动脉球囊导管损伤后血管内膜的增生，降低增生内膜中增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、cyclin D1、cyclin E和细胞外基质成分型胶原（collagen ，Col)、纤联蛋白（fibronectin, FN）的表达，能抑制血管内膜损伤后血管平滑肌细胞（va

12、scular smooth muscle cell，VSMC）细胞周期的激活，阻抑细胞增殖，抑制细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的合成和促进其降解3,4。三七总皂苷（total Panax notoginseng saponins，TSPN）是从中药五加科植物Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen干燥根中提取的皂苷类有效组分，是三七的主要药理活性成分，在三七中含量高达8%12%，其主要有效成分是人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）、人参皂苷Rb1（ginsenoside Rb1）和三七皂苷R1（notoginsenos

13、ide R1）等。研究表明，TSPN可显著抑制高脂血清对VSMC的促增殖作用5，抑制主动脉球囊损伤血管内膜增生模型大鼠血管内膜增生，降低增生内膜中cyclin D1、cyclin E和FN的表达，增强基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9，MMP9)的表达，提示TSPN可抑制血管内膜损伤后VSMC的过度增殖，减少ECM的沉积6。由于VSMC在血管增殖性病变中具有重要的地位，为了进一步阐明补阳还五汤、补阳还五汤有效组分及TSPN的作用环节，本研究采用血浆药理学方法和血小板衍生生长因子(plateletderived growth factor，PDGF）诱导的VSM

14、C增殖模型，研究补阳还五汤、 补阳还五汤有效组分和TSPN对VSMC增殖的影响。1  材料与方法1.1  实验材料1.2  实验方法1.3  统计学方法  应用SPSS 16.0统计学软件进行分析。实验结果数据采用x±s表示。多组间均数比较用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者用LSD法检验，方差不齐者用Dunnets T3法检验。检验水准=0.05。2  结果2.1  VSMC鉴定  倒置显微镜下，培养的VSMC贴壁生长，细胞呈长梭形，放射性生长，细胞胞质透明，相互融合在一起。成束的细胞平行排列，呈铺路

15、石样“峰谷”状生长。可见到VSMC胞浆中平滑肌肌动蛋白呈阳性表达，纯度达90%以上。表明培养的细胞为VSMC。2.2  空白血浆对VSMC生长的影响  随着浓度的增加，空白血浆对VSMC增殖的抑制作用逐渐增强，当空白血浆浓度达20%时，其对VSMC增殖的抑制率为39.41%，表明空白血浆对VSMC生长具有一定的抑制作用。而空白血浆浓度为15%时，对VSMC增殖的抑制率为16.99%。故在实验中所用血浆的浓度不超过15%。见图1。图1  空白血浆抑制VSMC生长的抑制曲线（略）Figure 1  VSMC growthinhibitory curve of

16、 blank plasma2.3  各含药血浆对PDGFBB诱导的VSMC增殖的IC50  各含药血浆可以显著抑制由PDGFBB诱导的VSMC增殖，随着浓度的增高，抑制作用增强，各含药血浆的IC50均为10%15%，各含药血浆IC50比较，差异均无统计学意义（P0.05）。由此确定各含药血浆的加入浓度均取10%。见表1和图2。2.4  各含药血浆对PDGFBB诱导的VSMC增殖的影响  随着培养时间的延长，各组VSMC增殖活性逐渐增强，其中以PDGFBB刺激组VSMC增殖活性最强，PDGFBB刺激组1248 h时的增殖活性显著高于无血浆空白对照组（P0.05）。空白血浆组的细胞增殖活性也较强，在1248 h时也显著高于无血浆空白对照组（P0.05），但其增殖活性略低于相应时间点的PDGFBB刺激组（P0.05），表明空白血浆对PDGFBB诱导的VSMC增