缺血再灌注期间大鼠脑线粒体的变化

1、    缺血再灌注期间大鼠脑线粒体的变化        摘要：目的观察局部脑缺血再灌注对大鼠脑线粒体呼吸链酶复合物活性、过氧化氢(H2O2)产生量和脂质过氧化水平(MDA含量)的影响。方法酶学方法，荧光法和比色法。结果缺血2h后复合物的活性即有明显下降，再灌注30min至4h均无恢复。酶重复合物活性缺血时无明显变化，再灌注30min开始下降，一直持续到再灌注4h。酶复合物活性在缺血与再灌注期间均无明显变化。缺血再灌注1h时脑线粒体过氧化氢产生量明显上升，再灌注2h后又恢复到正

2、常水平。MDA含量则是在再灌注2h开始明显增高，4h时仍维持较高水平。结论缺血再灌注可造成脑线粒体本身氧化损伤。关键词：再灌注损伤；脑；线粒体中分类号：R743;Q24文献标识码：A文章编号：1003-2754(2000)03-0133-03 Changes of rat brain mitochondria during ischemia and reperfusionZHAO Wei-hua,XU Jian-xing,CHEN Qing-tang.(Department of Neurology,The First Affiliated Hospital of Beijign Medica

3、l University,Beijing 100034,China).Abstract：ObjectiveThe effect of reperfusion following 2-hour focal ischemia on rat brain mitochondria. MethodEnzymology,Fluotometry,TBAR assay. ResultsMeasurement of the individual respiratory chain complexes showed that the activity of complex was reduced immediat

4、ely after 2 hour of ischemia,which continued during 0.5-to 1-hour of reperfusion;the activity of complex ,which was normal after ischemia,decreased significantly by 0.5- to 4-hours of reperfusion. In contrast,complex IV activity was unaffected by ischemia or reperfusion. After 1-hour recirculation,w

5、e found the generation of H2O2 increased significantly. The level of lipid peroxidation (the content of MDA) didn，t increase until 2-and 4-hour of reperfusion. ConclusionThese data suggested rat brain mitochondria were damaged by oxidative stress during ischemic reperfusion.Key words：Reperfusion inj

6、ury；Brain；Mitochondria随着脑梗死溶栓治疗的增多，再灌注所带来的负面影响也逐渐引起了人们的注意。早期的再灌注无疑对减小梗死灶，减少神经元损伤是有益的。但再灌注可能是一把“双刃剑”，再灌注本身对缺血组织也有损伤作用。研究表明，当细胞缺血达到不可逆的程度时，血流再灌会导致严重的脑水肿、氧自由基的过量产生、血管源性细胞(如中性粒细胞，巨噬细胞等)聚集1。既然脑缺血再灌注伴随着自由基的大量产生，而线粒体又被认为是自由基产生的主要场所，脑缺血再灌注时线粒体的变化就倍受关注。本实验就以此为目的，观察缺血再灌注对线粒体呼吸链酶复合物活性、过氧化氢(H2O2)产生量和脂质过氧化水平的影响，

7、通过分析不同时间点的变化情况以推断三者的相互关系。1对象与方法1.1对象建立大鼠局部脑缺血再灌注线栓模型2雄性Wistar大鼠 ， 体重为310±20g ， 按 0.4ml/100g腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，结扎颈内外动脉之间的分支和颈内动脉远端的翼腭动脉。结扎颈外动脉后，在颈外动脉结扎处近心端剪一切口，插线栓子(4.0尼龙线，长约5cm，头端涂牙拖粉与自凝水混合液)入颈内动脉22mm±,则线栓头部达到左大脑中动脉。此时计时为脑缺血开始时间。脑缺血2h后拔出线栓子至颈外动脉段，即为再灌注开始时间。再灌注不同时间后，断颈处死大鼠。取出完整脑组织，冻存于液氮中。实验分组：共

8、分6组，假手术组(Sham)，缺血2h组(1/2h)，分别再灌注30min，1h,2h,4h组(R/30m,R/1h,R/2h,R/4h)，每组6只。假手术组操作到结扎翼腭动脉为止，以该组作为对照。1.2方法制备脑线粒体3：取左侧大脑半球缺血部分，在分离介质(0.25mol/L蔗糖，0.5mmol/L EDTA-Na+, 10mmol/L Tris-HCl, 0.1% BSA, pH=7.4)中剪碎， 匀浆。 差速离心提取脑线粒体 ： 4 000r/min离心5min，取上清：10 000r/min离心10min，取沉淀，即为线粒体，分别悬浮于分离介质及1.15%KCl中，以上操作均在冰浴中进

9、行。测定呼吸链酶复合物活性4，5：将脑线粒体冻存于-20冰箱，24h后化冻进行呼吸链酶活性的测定。反应总体积为1.2ml，反应温度为25。(1)复合物： 0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH = 7.4) , 0.3mmol/L EDTA , 0.123mmol/L DCIP , 0.05 mmol/L TTFA , 0.167 mol/L KCN 中加入 0.4mg脑线粒体及电子供体2mmol/L NAPH，立即混合后，于UV-1601分光光度计上监测600nm处光吸收的变化。以消光系数21mmol/(L.cm)计算DCIP的还原速度。(2)复合物：0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH = 7.

10、4) , 0.3mmol/L EDTA , 0.107mmol/L DCIP , 4.17 mol/L 鱼藤酮 ， 0.167 mol/L KCN中加入 0.6mg脑线粒体及电子供体20mmol/L琥珀酸，立即混合后监测600nm处光吸收的变化。以消光系数21 mmol/(L.cm)计算DCIP的还原速度。(3)复合物：0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH = 7.4) , 0.3 mmol / L EDTA , 0.1 mmol / L Ctyc , 4.17 mol / L 鱼 藤 酮 ， 0.05 mmol / L TTFA , 0.167mol/L KCN中加入0.2mg脑线粒体及电子供

11、体30mol/L还原型C10Q2H2，立即混合后监测550nm处光吸收的变化。以消光系数18.7mmol/(L.cm)计算Ctyc的还原速度。测定脑线粒体H2O2的产生：采用Scopolitin荧光检测法6。反应总体积600l，反应温度30：50mmol/L磷钾缓冲液(pH=7.6),2nmol/L Scopolitin,0.33mol/L辣根过氧化酶，0.66mol/L 抗 霉 素 A 中 新 鲜 脑 线 粒 体 1 8 0 g ， 底 物 0.05mmol/L琥珀酸混合后，在荧光分光光度计(激发波长360nm,发射波长465nm)上可观察到荧光值的下降。在此条件下，Scopolitin/H

12、2O2=1.0，以此比值计算H2O2的产生量。测定脑线粒体脂质过氧化水平采用Ohkawa TBA反应法7。以消光系数1.56×105mol/(L.cm)计算脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量。1.3统计学处理用单因素方差分析(one-way AVONO)进行各组间的比较。2结果2.1缺血再灌注脑线粒体呼吸链酶复合物活性的变化见表1。复合物活性：缺血组比假手术组有所降低，但无明显统计学差异。再灌注各组均明显低于假手术组。复合物活性：缺血组和再灌注各组均明显低于假手术组。复合物活性：缺血组和再灌注各组与假手术组均无明显统计学差异。表1缺血再灌注期间大鼠脑线粒体酶复合物活性(单位：mol

13、/mg pro./min)的变化组别次数复合物复合物复合物假手术组缺血2h组再灌注30min组再灌注1h组再灌注2h组再灌注4h组65666617.4±2.415.1±2.013.1±2.5*12.1±3.1*12.2±2.9*14.0±2.4*17.7±6.68.1±1.5*12.4±6.4*12.4±3.4*8.8±1.6*11.5±2.9*149.2±17.8151.2±31.0154.4±32.0169.1±52.2132.1&

14、#177;16.6142.4±22.9注缺血组和再灌注各组均与假手术组比较*P<0.05， *P<0.012.2缺血再灌注脑线粒体H2O2产生量的变化见表2。R/1h组H2O2的产生量明显高于假手术组，其余各组虽略有升高，但与假手术组相比无统计学差异。2.3缺血再灌组脑线粒体脂质过氧化水平(MDA)的变化见表2。R/2h组及R/4h组MDA含量明显高于假手术组，缺血组、R/30m组和R/1h组与假手术组相比无统计学差异。表2缺血再灌注期间大鼠脑线粒体H2O2的产生量及MDA含量的变化组别次数H2O2的产生量pmol/(mg pro.min)MDA含量(nmol/100mg

15、 pro)假手术组缺血2h组再灌注30min组再灌注1h组再灌注2h组再灌注4h组66666626.0±10.734.2±16.031.0±7.639.0±8.1?31.8±11.430.7±7.740.8±7.760.8±21.843.0±6.658.0±20.367.4±15.1?63.8±23.0*注：缺血组和再灌注各组均与假手术相比较*P<0.05 3讨论线粒体是生成氧自由基的主要场所，这一点已有很多文献证实。但氧自由基是如何产生的呢?这一直是许多学者争论的话题

16、。最近，徐建兴教授对线粒体如何生成氧自由基提出了一个新的理论。他认为线粒体通过呼吸链电子传递进行能量代谢合成ATP的同时，还有一部分电子通过呼吸链电子漏机制进入超氧自由基代谢生成有害的活性氧。1是他最近给出的呼吸链功能示意8，的下半部分示意线粒体中复杂的超氧自由基代谢途径。1线粒体呼吸链的两条代谢路径呼吸链底物端(泛醌区)及氧端(细胞色素区)均有电子漏出；底物端的电子漏导致线粒体生成、H2O2还原成H2O，起到部分清除氧自由基的作用。多条代谢途径的复杂平衡决定着线粒体的氧自由基水平。正常生理状态下线粒体氧自由基水平较低，但在病理状态下氧自由基水平就会增高。运用徐建兴教授提供的示，可以对本实验结

17、果作出比较合理的解释。缺血时因氧没有储备，呼吸链处于低氧而高底物的还原状态，这正是有利于电子漏出的状态。另有研究表明脑缺血时线粒体内的Ctyc大多游离到胞浆中9，从而氧端清除自由基的电子漏减少，这也是造成氧自由基产生增多的原因。我们观察到缺血时H2O2的产生有增加的趋势。再灌流的瞬间给处于高还原态的呼吸链充氧，加速了氧自由基的进一步生成。本实验检测到再灌流后线粒体生成H2O2的速率再次增高正好符合再灌流损伤的这种分析。R/2h及R/4h时产生的H2O2又有所下降，这正是线粒体氧自由基代谢动态平衡过程的反映。氧自由基在再灌注损伤中起重要作用，氧自由基可直接损伤脑血管内皮细胞及平滑肌细胞，从而导致

18、血小板聚集，血管渗透性增加的继发性损伤10。同时，氧自由基介导的血-脑脊液屏障的破坏也是脑水肿的重要原因。更重要的是氧自由基还攻击脂质、蛋白、DNA等细胞内重要的大分子物质，破坏其功能。呼吸链电子漏产生氧自由基无疑对呼吸链本身的酶复合物和活性均明显下降，而酶复合物活性无明显改变，这可能与复合物和位于膜表面容易受到自由基的攻击，而复合物深埋于膜内较隐蔽有关。另外，酶复合物和含有很多铁硫蛋白，而酶复合物较少含这种结构，说明铁硫中心可能更易遭受氧化损伤。脂质过氧化损伤出现在再灌流的较后期，这是因为超氧自由基进入膜之前必须先和质子加合成HOO自由基，后者不带电荷方可以进入膜内。我们知道脑组织富含不饱和

19、脂肪酸，对维持正常的脑功能起着举足轻重的作用，脂质过氧化水平升高无疑影响缺血再灌注脑细胞的功能恢复。总之，我们的检测结果支持了脑缺血再灌注损伤与线粒体呼吸链电子漏现象有重要相关性，缺血再灌流过程中H2O2生成的动态过程可以用徐建兴教授引入的线粒体超氧自由基的生成和代谢过程加以解释。如果我们找到一种药物可以调整线粒体的代谢功能，防止呼吸链电子漏和氧自由基的大量生成，并将之应用到脑梗死溶栓治疗，无疑对卒中患者的神经功能恢复有很大的帮助。作者单位：赵卫华（北京医科大学第一医院神经内科，北京 100034）徐建兴（中科院生物物理研究所大分子实验室，北京 100101）陈清棠（北京医科大学第一医院神经内

20、科，北京 100034）参考文献1Kato H,Kogure K. Biochemical and molecular characteristics of the brain with developing cerebral infarctionJ. Cell Molecular Neurobiol,1999,19(1):93-108.2Memezawa H,Minamisawa H,Smith ML,et al. Ischemic penumbra in a model of reversible middle cerebral artery occlusion in the ratJ.

21、Exp Brain Res,1992,89:67-78.3Lai JCK,Clark JB. Prepartation of synaptic and non-synaptic mitochondria from mammalian brian J. Methods Enzymol,1979,55:51-60.4郭大海. 两种新呼吸链抑制剂对心肌制剂抑制作用的比较J. 生物化学与生物物理进展，1993，20(6)：446-451.5Trounce IA,Kim YL,Jun AS,et al. Assessment of mitochondrial oxidative phosphorylation in patient muscle biopsies,lymphoblasts,and transmitochondrial cell linesJ. Metho