纳米材料在电化学生物传感器中的应用

1、纳米粒子在生物电化学传感器中的应用赖自成先进材料与纳米科技学一章 电化学生物传感器概述1.1 电化学生物传感器的原理与分类 目前为止，生物传感器中研究成果较多的是电化学生物传感器。电化学生物传感器是以生物活性物质为敏感基元，以电化学电极为信号转换器，以电势、电流或电容为特征检测信号的生物传感器。当待测物质(底物、辅酶、抗原抗体等)扩散进入固定化生物敏感层，经分子识别，发生生物化学反应，继而被相应的化学或物理换能器转换成可定量和处理的电信号，再经过二次仪表放大并输出，便可得到待测物浓度。电化学生物传感器根据分子识别元件的不同，可分为酶电极传感器、电化学免疫传感器、组织电

2、极与细胞器电极传感器、电化学DNA传感器等;按照换能器的不同可以分为电位型、电流型、电导型和电容型等电化学生物传感器。1.2 生物组分的固定化要让生物组分作为传感器敏感膜使用，必须将具有分子识别能力的生物功能物质，如酶、抗原、抗体、细胞等，包藏或吸附于某种材料，形成一层敏感膜，这被称为生物组分的固定化。因为生物组分的固定化即使决定着生物传感器的稳定性、选择性和灵敏度等主要性能，所有选择合适的方法对生物组分进行固定生物传感器的研究和开发中具有至关重要的作用，应满足一下几个条件首先固定后的生物识别分一子仍能够保持很好的活性其次固定化层应有良好的稳定性与耐受性，且能适应多种测试环境最后是生物膜与转换

3、器必须紧密接触，这样有利于信号传输和转换。经过近几十年的不断研究，已经建立了多种生物分子固定化方法，目前，被广泛使用的固定化技术主要有吸附法、交联法、包埋法、共价键合法、组合法和电化学聚合法等。吸附法是通过物理吸附对生物分子进行固定，是一种较为简单、经济的方法。而且可供选择的载体类型相对较多，操作条件温和，对生物分子活性影响较小，但生物分子与固体表面结合力较弱，容易导致固定化生物分子的泄漏或脱落，并且生物分子暴露在外，容易受到温度、离子强度等环境因素的影响。交联法通常使用双功能基团试剂，在生物分子之间、生物分子与固定材料之间交联形成网状结构而达到固定化的方法。最长见的交联试剂为戊二醛，它能在温

4、和的条件下与蛋白的自由氨基反应，将蛋白交联起来。采用这种方法的局限性是膜的形成条件不易确定，须仔细控制、温度、离子强度及反应时间等。包埋法是将生物分子包埋在高分子等材料的三维空间网状结构中，形成稳定的生物敏感膜。该技术的特点是可采用温和的实验条件将生物分子掺入到高分子膜中，一般不会发生化学反应，对生物分子活性影响较小膜的孔径和形状可控，包埋的生物分子不易发生泄漏，可固定高浓度的生物分子。不是目前使用比较多的生物分子固定化方法。共价键合法使生物分子通过共价键与固体表面结合而固定的一种方法。这种方法一般要求在低温、低离子强度和生理条件下进行，并常加入底物以防止生物分子的活性部位与固体表面发生键合。

5、当想固体如电极表面共价键合生物组分时，需考虑很多因素。这样的过程通常包括三个步骤基底表面活化、生物组分的偶联及键合疏松的生物分子的去除。组合法是生物组分与基底材料简单混合以制备固定化生物膜的一种方法。这种方法制作简单，基底表面可更新，缺点是表面不均匀、重现性差，生物组分容易泄漏，且生物分子用量大，不易微型化等。电化学聚合法使用电化学聚合法制备生物敏感膜的方法，因为要用到电化学方法，所以通常是在电极表面进行。与传统的固定化方法相比，有以下优点简单，电化学聚合的固定化可一步完成并直接固定在电极表面聚合膜厚度和生物分子的固定量容易被控制和调节，从而制得重现性好的生物敏感膜而且有些聚合物膜具有选择性透

6、过某些物质的功能，可起到降低干扰、增加选择性的作用。1.3电化学生物传感器的发展在电化学生物传感器中，研究和应用最多的是酶传感器，这种将酶作为电极结合试剂的概念是由Clark和Lyons建立的，从这开创性的工作之后，在酶电极和其它电化学生物传感器方面均有大量的工作发表，涉及到几何学、固定化方法、电极的构象、膜的组成等等。以酶电极为例，根据酶与电极之间电子的转移机理， 大致可将电化学生物传感器的发展分为三代：第一代酶电极是建立在氧还原基础上，以葡萄糖氧化酶催化葡萄糖为例：随着O2浓度减小，H2O2浓度增大，通过检测产物H2O2浓度的变化或者氧的消耗量来测定底物浓度。该方法存在着一些明显的缺点如溶

7、解氧的变化可能引起电极相应的波动而且由于氧的溶解度有限，当溶解氧贫乏时，相应电流明显下降，从而影响检出限同时电极的响应性能受溶液的值及温度影响很大等。为了改进第一代酶电极的缺点，便诞生了第二代酶电极即介体型酶电极。由于酶一般都是生物大分子，它们的氧化还原活性中心往往被包埋在蛋白质分子里面，而电子传递速率与电子给体一受体间的距离是呈指数衰减关系，导致蛋白活性中心与电极表面之间的电子传递速率很慢或者很难进行。因此，为了提高蛋白活性中心与电极表面之间的电子传递效率，人们提出利用人为加入电子媒介体来解决这一问题。第二代酶电极增加了化学修饰层。基体经过化学修饰层修饰后，可以看成是一个经改进的信号转换器，

8、被称为电子转移媒介体，电子媒介体不但可以扩大基体电极检测化学物质的范围，同时也降低工作电势、提高了测定的灵敏度。电子媒介体在近十几年中得到了迅猛的发展，其种类也越来越多，按作用机理主要分为两大类一是含有过渡金属元素的化合物或配合物，它们通过过渡金属的价态变化来传递电子还有一种就是通过分子中的特殊官能团的结构变化来传递电子，这些化合物的共同特点是都含有大键的环及与环相联的双键，这些双键容易打开与再形成，电子的传递就是靠这些双键的打开与再形成来实现。为更好地发挥电子媒介的作用，媒介体应有以下要求应与还原态酶迅速反应减小氧气的竞争、具有较好的电化学性质如较低的氧化还原势、水溶性差且对生物酶没有毒害、

9、化学稳定性好等。常见的媒介体主要有二茂铁及其衍生物钌和锇等金属的配合物、铁氰酸盐、醌类、有机介体、有机染料和有机导电盐等。但是这类方法的缺点就是加入的电子媒介体容易污染电极，影响电极的性能。第三代酶电极的生物传感性能是通过酶在电极上的直接电化学催化来实现的，即所谓的无试剂传感器。其机理如图一所示。它利用酶与电极的直接电子转移，无需加入其它试剂，这样减少了操作步骤，是真正意义上的无试剂生物传感器。还是以葡萄糖氧化酶催化葡萄糖为例子：实现酶的直接电化学一直是生物电化学研究者努力的方向，这对于研制非媒介体的酶传感器是非常有意义的。由于酶与电极间难以直接进行电子转移，到目前为止，仅有氧化还原蛋白、过氧

10、化物酶、氧化酶、氢化酶和脱氢酶、超氧化物歧化酶等少数集中分子量较小的酶，能够在电极上直接进行有效的电子转移。酶的直接电化学已成为生物电化学研究中最重要的发展方向之一。酶作为一类典型的生物大分子和特殊催化剂，在生命过程中扮演着极其重要的角色。理论上，酶与电极间直接电子传递过程更接近生物氧化还原系统的原始模型而从应用的角度出发，酶直接电化学的实现可用于发展生物燃料电池等。因此，寻找更加有效的方法和手段实现更多酶的直接电化学，以满足生物医学、环境监测和工业快速分析的需要，必将成为该领域的发展趋势。电化学生物传感器的研究二十多年来取得了迅猛的发展，取得了显著的成绩，今天电化学生物传感器的研究和发展更加

11、迅速和深入，主要表现在以下几个方面实用的电化学生物传感器与系统越来越多微型化、智能化、集成化全面进入到电化学生物传感器研究开发随着人类基因组研究的深入进行和微纳米技术的普及与成熟，纳米传感器、基因芯片以及微全分析系统等新器件、新系统的出现，把电化学生物传感器的研究推进到一个崭新的发展阶段。第二章 纳米粒子在电化学生物传感器中应用概述进入二十一世纪，随着纳米材料与纳米技术的飞速发展，纳米材料在医学成像、医学诊断、药物传递、基因治疗等多个领域显示了巨大的优势。对于生物传感器领域而言，纳米材料在光学性能、电学性能、力学性能、磁学性能和化学活性等方面表现出的独特性能使其成为很好的换能器元件;另一方面，

12、生物传感器中分子运动本身就是纳米尺度范围的，纳米材料的参与可以将其优良的性能更好的整合到分子运作中，从而改进甚至革新分子运作体系。鉴于以上特点，纳米材料在电化学生物传感器中的应用引起了越来越多的科研工作者的兴趣，并逐步进入到生物传感领域，引发突破性的进展。2.1 金属纳米粒子在电化学生物传感器中应用概述金属纳米材料因其良好的电子传递性能成为电化学生物传感器中最为常用的纳米材料之一，如纳米金、纳米银、纳米铂等，其中尤以纳米金的应用最为广泛。纳米金制备简单、化学性能稳定、具有良好的生物相容性，同时易于进行表面修饰，因此，利用纳米金与生物分子构建电化学生物传感器是非常良好的策略。2003年，Will

13、ner课题组在science上报道了纳米金在电化学生物传感器的经典应用。他们将葡萄糖氧化酶(GOD)的辅基修饰到13nm纳米金球表面，然后通过双琉基化合物将辅基修饰的纳米金固定到金电极表面，最后引入脱辅基的GOD后，由于辅基与GOD的特异性结合，完整的GOD被最大限度的保持原有结构和活性，从而可以用来催化葡萄糖。再通过收集催化过程中经纳米金传递的电化学信号，达到对葡萄糖进行定量分析和检测的目的。此后，Willner课题组又利用纳米金胶与阴离子聚合物组成的微杆得到溶液相中GOD的电化学响应，从而实现葡萄糖的高灵敏检测。结果显示，纳米金的使用不但提高了生物酶与电极间的电子传递，而且微杆结构所提供的

14、巨大比表面积使得溶液状态下也可以获得GOD的电化学响应。近年来，基于纳米金与GOD所构建的各种葡萄糖电化学生物传感器层出不穷，并发展出一系列的优秀的实验方案。在纳米金得到应用的同时，其它金属纳米粒子如纳米铂、纳米银也得到了广泛的关注，利用DNA的互补配对或者凝血酶上的两个核酸适配体结合位点，研究者将DNA修饰的纳米铂通过夹心结构修饰到电极表面，利用纳米铂催化过氧化氢底物，得到相应的催化电流。实验证明，利用纳米铂良好的催化能力，凝血酶与核酸的检测限分别可以达到1 nM和10 pM。2.2 氧化物纳米粒子在电化学生物传感器中应用概述氧化物纳米材料在电化学生物传感器领域中主要应用于生物分子的固定，纳

15、米氧化物因其表面具有良好的亲水性和生物相容性，有利于生物分子如蛋白质保持其生物构型，通常可以实现蛋白质内部活性中心与电极表面的直接电子传递。同时除了具备纳米材料共有的一些性质外，纳米氧化物还依材料的不同具备一些特殊的效应，比如Ti02的光电效应、纳米Fe304的磁效应等。这些效应在电化学生物传感器的构建中可以产生一些意想不到的效果。李根喜实验组利用纳米Ti02与Hb共修饰后，将其在紫外线照射，发现Hb的催化活性大大提高，电化学检测H202的灵敏度提高了三倍，检测限降低了两个数量级。这一方面是由于Ti02纳米粒子对紫外线的屏蔽保护了蛋白质，另一方面，Ti02在紫外线激发下产生的活性物质促进了Hb

16、的催化活性;他们实验室在后续的研究中发现Zn0也具有类似的效用。图2-1 二氧化钛纳米粒子与血红蛋白共修饰电极示意图2.3 碳基纳米材料在电化学生物传感器中应用概述与金属纳米材料类似，碳基纳米材料也同样具备极好的电子传递能力、生物分子的高负载能力以及良好的生物相容性，同时，由于该类型纳米材料本身的基础是碳，因此其功能化将非常方便和多样。对碳基纳米材料物理化学性质的不断深入了解，以及对其功能的不断拓展，为其在生物传感器的构建打下了坚实的基础。目前，几种常见的碳基纳米材料，如碳纳米管、石墨烯、富勒烯、碳纳米球、碳纳米纤维等，已被广泛的应用到电化学生物传感器的研究当中。石墨烯(Graphene)，是

17、一种由单层sp2杂化碳原子构成的六元环蜂窝状二维材料，厚度仅为0。335 nm，自2004年诞生之日起，石墨烯便以其独特的结构和优异的性能轰动整个科学界，掀起了人们对石墨烯经久不息的研究热潮。在石墨烯的二维平面上，每个碳原子与相邻的三个碳原子以键相，键长约为0。142nm，这些碳-碳 键的形成使石墨烯具有良好的结构刚，每个碳原子还剩下一个P轨道垂直于石墨烯平面，这些相邻的P互交盖重叠形成离域大键，电子可以在石墨烯平面内自由移动，这种稳定的刚性晶格结构赋予了石墨烯优异的导电性能。 石墨烯是形成其它维数碳材料的基本结构单元，它可以折曲形成零维的富勒烯，或卷曲形成一维的碳纳米管，也可以堆叠形成三维的

18、石墨，因此被誉为“碳材料之母”。石墨烯具有独特的力学、光学、热学和电学性能，在场效应晶体管、光伏电池、超级电容器、石墨烯/聚合物纳米复合材料、气体与生物传感、药物传输、燃料电池、储氢等领域有着广泛的应用前景。石墨烯由于具有高的导电性以及大的比表面积，修饰在电极表面后，可以在很大程度上提高其它分子在电极表面的吸附量，因此石墨烯是一种性能优异的修饰电极的理想材料，被广泛用于电化学传感器中以检测各种气体分子、有机小分子、生物大分子等。在透射电镜下石墨烯呈现透明的，有小褶皱的薄片状。图2-1 石墨烯透射电镜图目前石墨烯的功能化主要分为共价法和非共价法两大类。尽管完美的石墨烯化学性质稳定，但实际制备的石

19、墨烯的边缘及缺陷部位仍具有较高的活性，尤其是通过化学法制备的石墨烯，其表面及边缘含有大量的梭基、拨基、轻基、环氧基等，为石墨烯的进一步共价改性提供了活性位点。根据石墨烯表面的活性基团，目前石墨烯的共价功能化主要分为羧基功能化、环氧基功能化以及碳骨架功能化三大类。此外，也可以将功能化与还原结合进行，二者既可同步进行，也可在表面活性剂存在下先还原后功能化等，以达到既提高石墨烯的导电性又实现功能化的双重目的。石墨烯的非共价功能化主要是通过-作用、离子键、氢键等超分子作用对石墨烯进行功能化，以提高其溶解性或分散性，并赋予石墨烯新的性能。此外，通过简单的物理吸附也可将一些金属纳米粒子(如Au， Ag，

20、Fe， Pd， Pt等)吸附到石墨烯表面，从而得到一些具有特殊性能和用途的金属纳米粒子功能化的石墨烯纳米材料。相比较而言，共价法由于发生了化学键的改变会部分破坏石墨烯的本征结构而改变其本征性能;而非共价功能化的方法操作简单，条件温和，一般不会破坏石墨烯的本征结构和性能，但是相互作用力比较弱。因此具体的功能化应结合具体的用途，在保持石墨烯特殊结构和优良险能的基础上寻求新的突破。景雁凤等构建了一种基于石墨烯-Zn0(GR-ZnO)复合物的乙酰胆碱酯酶生物传感器，并用于快速灵敏的检测辛硫磷农药。不同电极在5.0 mmol/L K3Fe (CN) 6(含有0.1mol/L KCl)溶液中的循环伏安曲线如图2-2所示。 与裸玻碳电极(曲线a)相比，CHI修饰后