微尺度流动显示及速度测量解读

1、微尺度流动显示及速度测量李战华 郑旭中国科学院力学研究所 非线性力学国家重点实验室（ LNM ），北京 100080摘 要：本文综述了微尺度流动显示和速度测量的前沿技术：MicroPIV 、Confocal、TIRFM、MTV 、QD 等，介绍其工作原理、主要技术指标、适用范围等。通过对各种系统的分析说明观测微流动需要解决的主要问题，为进行微流 动的实验研究和发展微流动观测技术提供参考。关 键 字： 微流动、流动显示、 MicroPIV 、 Confocal、TIRFM 、MTV 、 QD1. 引言微尺度流动是指特征尺度在 0.1 m 1mm 之间的流动，通常出现在微机电系统（ MEMS ），

2、特别 是微流控芯片（ Microfluidic ）中。例如， DNA检测使用的毛细管电泳芯片，微分析系统 （ TAS） 中使 用的微分离器、微阀等器件，均由微米尺度的通道组成。微尺度流动的主要特点是：低 Re 数，表面 力作用为主，与 Capillary 数、 Bond 数有关， 工作液体多为复杂液体等。 微尺度流动特性对系统的性 能有很大影响，对微流动特性的研究一直受到关注。微流动特性研究的重要手段之一是进行流场观测。 微尺度流动显示与宏观流动显示主要不同是需 要提高空间分辨度和利用高亮度探测仪器等。宏观速度测量仪器的空间分辨率在几十微米以上：热 膜流速仪的探头直径为 5 m，长 1.25m

3、m， LDV 的光斑直径约 2mm，这些仪器无法用于微尺度流动 测量。宏观流动显示的示踪粒子直径 >1 m，而微流动中的荧光示踪粒子直径在 50-500nm 。按照 Reyleigh 散射定律粒子光强与直径的 6 次方成比例衰减，因此需要高光学灵敏度探测器。为了实现 微尺度流动诊断，必须对宏观流动显示方法进行改进，采用新的实验仪器或手段。目前微流动显示方法很多，按照所使用的显微镜系统分为：倒置荧光显微镜、透射显微镜系统、 共聚焦显微系统 Confocal 等。按照选用的入射光种类分为：利用激光光源的 Micro-PIV ，利用 x 射 线的 X-PIV ，利用近场隐失波的 TIFMR 等

4、。按照选用的示踪粒子分为：荧光粒子法、分子示踪法和 量子点示踪法等。 本文将综述微尺度流动显示和速度测量的主要方法：MicroPIV 、Confocal 、TIRFM 、MTV 、 QD 等，介绍其工作原理、主要技术指标、适用范围等。通过对系统的分析说明观测微流动 的困难和需要解决的主要问题，为进行微流动的实验研究、观测微流控器件的流动特性和发展微流 动观测技术提供参考。2. 微观粒子图像测速（ Micro-PIV ）2.1 特点与发展现状（ 1） 原理Micro-PIV 是将宏观 PIV 测量原理应用于微尺度流动的流场测量技术， 它在宏观 PIV 测量系统中 增加了光学显微镜（图 1），利用

5、粒子的荧光提取流场信息。（ 2） 发展现状著名实验流体力学家 Adrian 研究组的 Santiago（ 1998）1 首次利用连续激光器、 CCD 和荧光显微 镜组成 Micro-PIV 系统，测量了绕 30 m柱体的 Hele-Shaw 流。实验中采用的示踪粒子是直径为 300nm的荧光粒子， 吸收光波长 532nm，发射光波长 560nm。实验雷诺数 Re=3×10-4，流速为 50 ms-1。Meinhart et al（ 1999） 2 利用双脉冲激光的 MicroPIV 系统（图 1b），实现了 30 m×300 m 矩形微管道内的速 度观测，流速达到 8 mm

6、s-1，速度测量的空间精度达到 0.9 m。Stone et al（2002）3利用软件处理技 术使 MicroPIV 系统在近壁区速度测量的均方根不确定度达到60nm ，为流道内表面的非接触式测量提供了新的方法。 国内李战华研究组 （ 2003）4对连续荧光下 MicroPIV 的最小测量速度进行了分析， 并对 30×50 m 微管道低 Re 数流动速度剖面进行了测量。郝彭飞和何枫（2005） 5 利用 Micro-PIV（b） 中科院力学所 MicroPIV 系统照片观测了 200 m 微槽道的湍流转捩和结构，发现在微管道中同样存在湍流流动模式。王旻利和王元 （ 2005）6详细

7、综述了 Micro-PIV 技术近年来的发展，并介绍了他们的实验测量结果。(a) MicroPIV 系统示意图 2图 1 MicroPIV 系统示意图和照片2.2 主要技术参数（1）空间分辨率 光学分辨率 光学仪器形成图像的清晰程度受光衍射现象限制。 根据 Rayleigh 判据，光学仪器的像分辨率 为：0.61 （2） NA n sin其中 为成像光波波长， NA为物镜数值孔径， n为介质折射率， 镜口角。对油镜 n为 1.516 ， 约 140 150 ， 为 630nm ，则分辨率 0.394 m。空间光学分辨率只与光波波长和物镜的数值孔径有关，因此 X-PIV 采用 x 射线（ 300

8、nm）， 相对于 650nm 光波，空间分辨率可以提高一倍。速度场测量分辨率 流场图像由 CCD 采集后被数字化，速度场的空间分辨率 s 可以表示为：S L （3）MW N其中 L 为物理平面内的观测长度、 Mw 为物镜放大倍数、 N 为 CCD 在观测长度内的点阵数。当使用100 倍物镜时， 视场 80 m，L 为 8mm。CCD 的像素 1002 ×1024，对应空间长度 8nm。光斑单点化后， 速度场测量分辨率可达 80nm。（2）工作距离工作距离为物镜到标本的距离（已扣除盖玻片的厚度约 0.17mm）。这个参数对微流动实验很重 要，因为它限制了微流道观测表面的厚度。对于 10

9、0 倍的物镜，工作距离只有 0.1mm。Depth of field ），由下式确定：（3）焦点深度和测量深度 焦点深度 显微镜光轴焦点上下可以看清物体的范围叫做焦点深度或景深（Z n 2 ne (4)Z NA2 M NA其中 n为介质折射率、 NA 为镜头数值孔径、 M 为显微镜总放大率、 e 为图像探测器的最小分辨率。 当使用 100 倍物镜和 10倍目镜时 (M=100×10)，n=1.515，CCD 在 1×1工作模式下， e为 8 m，则焦 点深度为 0.522 m，可以清楚地观察到焦点 0.261 m 范围内的物体。测量深度由于 MicroPIV 是体照明， M

10、einhart et al( 2000)7按照测量区域内某一平面粒子灰度与焦平面粒 子灰度的相关性确定沿光路的测量范围，定义了测量深度。测量深度与焦点深度和粒子有效直径有 关。其计算公式为：7)Zm 3n NA2 2.16d p / tan dp在 60 倍物镜， NA=1.4 下，测量深度约为 1.75 m 。由于显微镜的景深和体照明特性，在目前 MicroPIV 系统中实现 2D 观测比较困难，采用共聚焦 显微镜可以改进平面观测(见 §3)。(4) 示踪粒子荧光粒子宏观 PIV 的示踪粒子直径 >1 m，利用粒子散射光采集速度信息。而MicroPIV 利用的示踪粒子直径在

11、50-500nm ，其散射光不足以被观测，因此采用荧光示踪粒子。荧光是发射光，当入射光照到 样品上，样品内分子运动状态发生变化，样品分子吸收外来光能从高能级回复到低能级释放光能形 成荧光。在理想情况下，一个分子大约能辐射出105106 个荧光光子。高效单光子计数器可以检测到 5的荧光光子约 5000 个，足以探测到单个分子。布朗运动根据 Einstein 公式计算粒子扩散距离， 略布朗运动的最小速度约为 13 m/s。荧光粒子的浓度Li et al (2003) 4 计算了定常流场中直径 200nm 粒子可以忽Meinhart et al (2000)7给出 4种粒子浓度在 4 种测量距离下的

12、信噪比。根据作者的实验经验，使用200nm 粒子时，浓度范围为 0.02 0.1%为宜。荧光粒子的浓度对背景噪音影响很大。(5) 光信号检测器由于使用荧光粒子作为示踪粒子， MicroPIV 对 CCD 的光学灵敏度要求高。 Lee (2005)8给出 不同种类 CCD 适用的范围 (图 2)。微流动显示至 少需要选择量子效率高和暗电流低增强 CCD ( ICCD )和冷却 CCD(Cooled CCD) 。(6) 图像处理技术 王旻利和王元( 2005) 6 详细综述了 Micro-PIV 图像处理技术，可以参考。 图 2 不同种类 CCD 的量子效率示意图3. 激光共聚焦显微镜( Lase

13、r scanning Confocal Microscop)e图3 共聚焦显微镜原理示意图 9图4 共聚焦显微镜扫描系统示意图 103.1 原理共聚焦显微镜与传统场式 (wide field) 显微镜相比具有控制焦深、 降低背景杂光的优点。 通过空间 过滤技术去除非焦平面信息获得光学切片。从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光 通过原透镜应当汇聚回到光源， 这就是所谓的共聚焦 (图 3)。共聚焦光学系统是对样品进行点照明， 同时反射光也采用点感受器受光。只有与焦点重合的图像会被输出，因此无用的散乱光被屏蔽掉， 有效地降低了背景干扰。共聚焦显微系统可以

14、用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像 (图 4)。由于激光束的波长较短，光束很细，所以激光共焦显微镜有较高的分辨力，大约是普通光 学显微镜的 3 倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获 得样品不同深度层次的图像。3.2 技术指标实用共焦显微镜在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(dichroic mirror )，将已经通过透镜的反射光折向一套微透镜和光学针孔系统，将进入物镜的光线再次聚焦，以克服普通显微镜焦点深度 过大的影响。 例如 Olympus 荧光显微镜 IX70 的景深为 3 m，而共聚焦显微镜的景深只有 0.5 m，可 以更准确地显示指

15、定平面的图像。Oshima et al (2005) 11 使用 CSU22(Yokogawa Electric Corp.) Confocal Micro-PIV 系统具有 1000 帧 /秒的采样速度，在 40× /NA=1.25 物镜采用 500nm 荧光粒子对血管流动进行了观测。4. 全内反射荧光显微镜( Total Interior Reflect Fluency Microscope -TIRFM )4.1 原理 光波从光密介质射向光疏介质，入射角大于临界角时，会发生全反射现象。这时，尽管所有的 光全部被反射回光密介质，但由于波动效应，部分光的能量会穿过光密介质透入光疏介

16、质很薄的一 层表面，平行于界面传播。这种透入光疏介质表面的波，称为隐失波(Evanescent wave)。在低折射率介质中隐失波的典型渗透深度为100nm。如果样品紧贴界面放置，则隐失波对样品的垂直照射深度也为 100nm。相比荧光显微镜的焦点深度 2 3 m，共聚焦显微镜的焦点深度为 500 800nm，因此 全内反射显微镜具有极高的信噪比。4.2 技术参数 目前全内反射显微镜成像系统有两种类型：棱镜型和物镜型12 。棱镜型系统，是让激光通过棱镜产生全内反射的同时，在界面处产生隐失波(图5)。其特点是结构简单，但放置样品的空间受棱镜的限制；物镜型是显微镜的物镜即作为接收样品荧光信号的接收器

17、，同时又作为发生全内反射的光学器NA=1.65 的物镜。其优点是样品放置方便，容易与其他件。要求物镜的数值孔径大于 1.38 。目前已用到技术结合。棱镜法比较经济，物镜法的成本较高。图 5 全内反射显微镜原理示意图 12 图 6 实验照片 13盖宏伟等（ 2005）13利用棱镜型全反射显微系统观测了DNA 分子的近壁流场的运动。使用仪器的主要参数， 20×物镜 （NA=0.75） ，微流道 300 m×10 m，曝光时间 111ms， 22.1ms 延迟，观测范围 57.6 m×86.4 m。5. 分子示踪技术( Molecular Tagging Method

18、- MTV )5.1 原理MTV 是在 ?t 时间间隔内，用两束激光分别照射分子标记的区域（一般是分子标记的线） ，再用 CCD 记录两次照射的图片，对图片进行相关处理。图 7 给出了装置示意图，图 8 为分子标记区域和 速度场处理结果。MTV 所采用的分子示踪，不同于常用的荧光或激光诱导荧光 （LIF） ，它是利用磷光进行可视化。 荧光是由于单基态分子向单激发态分子转变过程中发射出的光，其过程是量子力学过程，持续时间 往往只在 10-9 10-7s 范围内；而磷光则是由单基态向多激发态转变，其过程是非量子力学过程，所以持续时间比荧光时间长很多，可以达到10-3 101s10 。图 7 MTV

19、 装置示意简图 14图 8.CCD 拍摄的分子标记区域及处理得到的二维速度结果 145.2 应用MTV 技术最先是在宏观尺度发展起来的，由Koochesfahani（1997）14 （2001）15研究组提出，利用分子标记线的旋转来分析湍流运动。最近 Hu et al.16 又对该技术进行了发展，使其不仅适用于 速度测量，还可以进行温度测量。但 MTV 测量设备和一般 MicroPIV 设备有一定的差别， 例如 MTV 一般需要两台激光器来照射， 如果需要观察三维流动结果， 则需要 4 台激光器。 另外由于磷光也有其衰减时间， 那么 CCD 的拍摄 速度也有一定的要求。根据文献记载，为了避免磷

20、光衰减过多， CCD 的曝光时间多在几个毫秒。6. 量子点技术（ Quantum Dots - QD）6.1 原理量子点是化学合成的半导体纳米粒子，其典型尺寸在 1 10nm 范围。 Murray et al.（ 1993） 17 最 先报道了化学合成量子点的方法， Hines et al.（1996）18和 Dabbousi et al. （ 1997） 19进一步发展了 量子点的制作方法。现在的量子点是以纳米半导体晶体CdSe 为核，镀以 ZnS 为壳，最外层还镀上高聚物以保持量子点的光学性质 （图 9）。近年来， 量子点已经被应用于生物标记 20 ，并已逐渐被用于 作为微流动实验的示踪粒

21、子 21 。量子点突出特点主要有以下 4 点： （1）QD 粒径介于传统荧光粒子和示踪分子之间，随体性更好； （2）QD 激发波长范围很宽，有较高的激发强度 （图 10）, 而且激发持续时间比较长，稳定性好； （3）QD 更适合于近壁区域的测量 （配合 TIF） ，而这正是传统荧光粒子缺点； （4）在光学显微镜下， QD 的有效 粒径比传统荧光粒子小，这将有助于提高空间分辨率，减小判读区，降低所需荧光液体浓度。图 9 QD 结构示意图 22图 10 各种颜色 QD 的激发谱 226.2 应用QD 在从生物化学方面的实验观测， 到流动示踪， 都有很好的适用性。 这主要是由其光稳定性好， 光激发强

22、度高，随体性好的特点决定的。同时 QD 有多种被激发色，激发波长范围宽，对激发光没 有特殊要求。同时量子点也存在着一些局限性，例如 QD 的制备合成过程比较麻烦，对环境的要求也比较高， 配成的样品也需要在比较洁净温度适宜的环境中保存。在测量时存在着量子点的闪现 （blink） 现象。 这是由于粒径太小，扩散系数大，强烈的布朗运动使量子点离开观测的焦平面，以至于在一系列拍 摄的图片中无法找到对应的粒子。7. 结论Micro-PIV 是目前微流动显示和速度测量的主要手段。为了改进焦点深度（ 2 3 m）影响，可以 采用共聚焦显微镜 Confocal （焦点深度为 500 800nm）和全内反射显微

23、镜 TIRFM （垂直照射深度为 100nm）。为了提高对流场的观测能力可考虑用分子点和量子点作为示踪粒子。本文仅介绍了微尺度液体的流场显示和速度测量，没有综述气体微流动的测量，也没有综述其 他流动参数（温度、浓度和密度）的测量。感谢 Olympus 公司阎松纯工程师和 Cold Spring 公司张博经理给予的技术咨询。参考文献1 Santiago JG, Wereley ST, Meinhart CD, Beebe DJ, Adrian RJ. A particle image velocimetry system for microfluidics, Experiment in Flui

24、ds. 1998, Vol.25, pp 316-319;2 Meinhart CD, Wereley ST, Santiago JG. PIV Measurement of a Microchannel flowExperiment in Fluids 1999, Vol.27,pp414-419;3 Stone SW, Meinhart CD and Wereley ST. A microfluidic-based nanoscope, Experiments in fluids . Vol.33, 613-619.TH4 Li ZH, Bstien O and Cui HH. Visua

25、lization of lower velocity flow field in microchannels, 7 Asian Symposium on Visualization , 2003, Nov.3-7, Singapore.5 郝彭飞、何枫（ 2006），第六届全国流动显示会， 2006.Oct13-16 ，福建；6 王旻利、王元 . Micro-PIV 技术粒子图像测速技术的新进展 .力学进展 ，2005,Vol.35, No.1, 77-90.7 Meinhart CD et al. Measurement Science Technology, 2000, Vol.11, p

26、p809-814;TH8 Lee SJ. MicroPIV application, 8 Asian Symposium on Visualization , 2005, May 23-26, Thailand.9 Yan SC. Laser Scanning Confocal Microscope. Technique paper, 2006.TH10 Ho CM. Visualization in the Micro/Nano domains, 7 Asian Symposium on Visualization , 2003, Nov.3-7, Singapore.11 Oshima M

27、, Kinoshita H. and Bannodo Y. Visualization and measurement of blood flow in the macro and micro scales, TH8 Asian Symposium on Visualization , 2005, May 23-26, Thailand.12 王琛、王桂英、徐至展 . 全内反射荧光显微术 . 物理学进展 , 2006, Vol.12, No.4, 406-415.13 Gai HW, Li Y, Silber-Li ZH, Ma YF and Lin BC. Simultaneously me

28、asurements of the flow velocities in microchannelby wide/evanescent fields illuminations with particle/single molecules. Lab on a Chip, 2006, Vol.5 (4): 443- 449.14 Gendrich CP, Koochesfahani MM and Nocera DG. Molecular tagging velocimetry and other applications of a new phosphorescent supramolecule

29、. Experiments in Fluids . 1997, Vol.23, 361-372.15 Bohl DG , Koochesfahani MM and Olson BJ. Development of stereoscopic molecular tagging velocimetry. Experiments in Fluids . 2001, Vol.30, 302-308.16 Hu H and Koochesfahani MM. Molecular tagging velocimetry and thermometry and its application to the

30、wake of a heated circular cylinder. Measurement Science and Technology. 2006, Vol.17, 1269-1281.17 Murray CB, Norris DJ and Bawendi MG. Synthesis and characterization of nearly monodisperse CdE semiconductor Nanocrystallites. Journal of the American chemical society , 1993, 115(19):8706-8715.18 Hine

31、s MA, Guyot-Sionnest P. Synthesis and characterization of strongly luminescing ZnS capped CdSe nanocrystals. Journal of Physical Chemistry . 1996, 100(2):468-471.19 Dabbousi BO, Rodriguez-Viejo J, Mikulec FV , Heine JR, Mattoussi H, Ober R, Jensen KF and Bawendi MG. (CdSe)ZnS core-shell quantum dots: synthesis and characterization of a size series of highly luminescent nanocrystallites. Journal of Physical Chemistry B. 1997, 101(46):9463-9475;