大鼠急性肾脏缺血再灌注后处理动物模型的建立(一)

1、大鼠急性肾脏缺血再灌注后处理动物模型的建立(一)    作者：陈光磊，王汉民，刘广厚，陈威，何丽洁，孙世仁，张鹏 【摘要】 目的：建立肾脏缺血后处理动物模型. 方法：将40只SD大鼠随机分为对照组、缺血再灌注组（IR组）和3个缺血后处理组（IPO1，IPO2，IPO3组），分别制作动物模型. IR组在同时夹闭双侧肾动脉45 min后恢复血供，IPO1，IPO2和IPO3组在肾缺血45 min后分别采用不同的后处理方法，其中IPO3组采用反复10次再灌注20 s-缺血20 s的后处理方法. 恢复血供24 h后留取各组大鼠静脉血标本及肾组织，检测肾功能指标，

2、光镜下观察肾组织形态学变化并对肾小管损伤程度进行评分. 结果：IPO3组血尿素氮为（27.9±3.2） mmol/L，血肌酐为（232±49） mol/L，肾小管损伤程度评分为382±48. 和IR组相比，IPO3组的血尿素氮、血肌酐及肾小管损伤程度评分均明显降低（P0.01），肾组织损伤明显减轻，其余两个缺血后处理组与IR组相比差异无统计学意义（P>0.05）. 结论：在急性肾脏缺血后，采用IPO3组的方法可以减轻急性肾脏缺血再灌注损伤，从而成功建立大鼠急性肾脏IRI的后处理动物模型. 【关键词】 缺血后处理0引言急性肾脏缺血再灌注损伤（ischemia

3、reperfusion injury，IRI）是一种常见的临床病理生理过程，多见于低血容量性休克、急性肾动脉阻断以及肾脏移植等情况，可以造成急性肾衰竭或使移植肾功能延迟恢复. 因此，如何有效防止因急性肾脏IRI而导致的各种急慢性肾脏疾病是一个亟待解决的问题. 2000年，陶凌等1在国内首先证实了缺血后处理（ischemic postconditioning，IPO）对急性心肌缺血再灌注兔心脏具有保护作用，此后，更多研究者2-4把研究对象拓宽到不同物种和不同器官，建立了IPO动物模型，并对IPO保护作用机制进行了探讨. 但是，肾脏IPO是否同样具有对急性肾脏IRI的保护作用尚不清楚. 我们在大鼠

4、急性肾脏IRI模型基础上，探讨建立肾脏IPO大鼠模型的方法.1材料和方法1.1材料健康雌性SD大鼠40只，体质量（236±10）g（第四军医大学实验动物中心），动物许可证号SCXK（军2002005），标准饲料喂养，正常饮水，普通光照. 血尿素氮、血肌酐试剂盒（化学法）（南京建成生物工程研究所）；721分光光度计（上海精密科学仪器公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）.1.2方法t检验，应用SPSS 13.0软件进行统计学处理，以P0.05为差异有统计学意义.2结果2.1血尿素氮及肌酐与S组相比， IR， IPO1， IPO2， IPO3组的血尿素氮及血肌酐均显著增高（P0.0

5、1）. 与IR组相比，IPO1组的血尿素氮和血肌酐略有增高、IPO2组略有降低，但均无统计学意义（P>0.05），IPO3组的血尿素氮和血肌酐均明显降低，差异有统计学意义（P0.01，表1）.表1各组SD大鼠血尿素氮、血肌酐及肾小管损伤程度评分的比较（略）2.2肾脏组织形态学的变化图1各组SD大鼠肾脏形态学改变PAS ×200略3讨论1986年，Murry等7发现在急性缺血再灌注出现之前对心脏进行反复多次的短暂缺血再灌注（即缺血预处理）可以减轻心脏的IRI，此后，Islam等8证实了预处理对肾脏急性IRI同样有保护作用. 然而在临床中，如果一旦发生IRI，则预处理难以实施，因此

6、，研究在缺血后对再灌注进行处理更具有实用价值. 2000年，我国学者1首先证实了IPO对急性心肌IRI具有保护作用，此后，Zhao等2和Kin等9的研究分别证明了IPO可以减轻犬和大鼠心脏IRI. 不仅在心脏，随后的一些研究针对肝脏3、脑4等组织进行IPO，证实对其相应器官的IRI也可产生保护作用，并对保护作用机制进行了探讨. 但是，以往的国内外众多研究并未涉及到肾脏器官，而且针对大鼠心脏等器官的研究中，单次后处理的时间和后处理的循环次数也不尽相同10，因此，在开展针对肾脏IPO作用效果及作用机制的研究之前，首先需要建立成功的大鼠肾脏IPO模型.在国外许多大鼠缺血再灌注的急性肾衰模型研究5,

7、11中，都将肾脏缺血时间限定在45 min，我们在本研究中同样将缺血时间限定在45 min，通过预实验成功复制了大鼠急性肾脏IRI模型. Yang等12通过对研究发现，如果在开始再灌注10 min后再进行后处理将丧失对IRI的保护作用，更多的研究9,13发现，如果在开始再灌注1 min之后再进行后处理，同样会使其对心肌IRI的保护作用丧失. 最近，Tang等10的研究显示，不同的后处理循环次数和心肌梗死面积有关，单次后处理时间过长、后处理循环次数过少都有可能限制其心肌保护作用的发挥. 因此，我们在成功复制了大鼠急性肾脏IRI模型的基础上，重点针对单次后处理的时间和后处理的循环次数进行了研究，以

8、期成功建立大鼠急性肾脏IRI的后处理动物模型.我们在实验中对大鼠肾脏缺血后采用了3种不同的后处理方式，从功能学和形态学角度对后处理的效果进行了分析，以便选择合适的肾脏缺血后处理动物模型. 结果显示，相对于IR组，采用反复5次恢复血供3 min-阻断血供3 min的后处理（IPO1组）并不能减轻急性肾脏IRI，反而可能加重损伤；采用反复5次恢复血供20 s-阻断血供20 s的后处理（IPO2组）能使肾功能指标改善，但无统计学意义. 而采用反复10次恢复血供20 s-阻断血供20 s的后处理组（IPO3组）和IR组相比，肾功能指标明显改善，肾组织中未见肾小管上皮细胞脱落和基底膜裸露，间质水肿、刷状

9、缘消失、管腔扩张、管型等改变也较IR组轻，对肾小管损伤程度评分的分析同样支持上述结果.综上所述，在急性肾脏缺血后及时采取反复10次的短暂（恢复血供20 s-阻断血供20 s）后处理，可以减轻急性肾脏IRI，从而成功建立大鼠急性肾脏IRI的后处理动物模型，为进一步研究IPO对大鼠肾脏的保护作用机制奠定了基础.【参考文献】1 陶凌, 李源, 高峰,等. 缺血后处理对急性心肌缺血再灌注兔心脏的保护作用J. 第四军医大学学报, 2000, 21(6): S116-S118.2 Zhao ZQ, Corvera JS, Halkos ME, et al. Inhibition of myocardial

10、 injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic preconditioningJ. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2003, 285(2):H579-H588.3 Sun K, Liu ZS, Sun Q. Role of mitochondria in cell apoptosis during hepatic ischemiareperfusion injury and protective effect of ischemic postc

11、onditioningJ. World J Gastroenterol, 2004, 10(13): 1934-1938.4 Danielisova V, Nemethova M, Gottlieb M, et al. The Changes in Endogenous Antioxidant Enzyme Activity After PostconditioningJ. Cell Mol Neurobiol, 2006, 26(78):1179-1189.5 Basile DP, Donohoe D, Cao X, et al. Resistance to ischemic acute r

12、enal failure in the Brown Norway rat: a new model to study cytoprotectionJ. Kidney Int, 2004, 65(6):2201-2211.6 Paller MS, Hoidal JR, Ferris TF. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the ratJ. J Clin Invest, 1984, 74(4): 1156-1164.7 Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning

13、 with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardiumJ. Circulation, 1986, 74(5):1124-1136.8 Islam CF, Mathie RT, Dinneen MD, et al. Ischaemiareperfusion injury in the rat kidney: the effect of preconditioningJ. Br J Urol, 1997, 79(6):842-847.9 Kin H, Zhao ZQ, Sun HY, et al. Postcondi

14、tioning attenuates myocardial ischemiareperfusion injury by inhibiting events in the early minutes of reperfusionJ. Cardiovasc Res, 2004, 62(1):74-85.10 Tang XL, Sato H, Tiwari S, et al. Cardioprotection by postconditioning in conscious rats is limited to coronary occlusions 45 minutesJ. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006, 291(5): H2308-H2317.11 Spandou E, Tsouchnikas I, Karka