实验十一应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本

1、实验十一应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本实验目的1. 熟悉一般细胞融合技术。2. 染色体提前凝集标本的制备原理、方法及间期细胞三种时相提前凝集染色体的特点。实验原理细胞融合是指在自然条件下或用人工方法（生物、物理或化学方法）使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞过程。细胞融合目前已被广泛应用于生物学和医学研究的各个领域。细胞融合的诱导物种类很多，常用的主要有灭活的仙台病毒，聚乙二醇（peg）和电脉冲。目前最广泛应用的是聚乙二醇。peg的促融机制尚不清楚，它可能引起细胞中磷脂的酰键及极性集团两者在结构上发生重排。在间期细胞中，遗传物质（dna）是以染色质形式存在的，看不到分裂期（m期）才出

2、现的染色体。七十年代初，由于发现m期细胞内有某种促进染色体凝集的因子（已知是m期促进因子，mpf），它无种属特异性，所以在细胞融合和染色体制片技术的基础上，建立了制备染色体提前凝集标本的方法。即让m期细胞与间期细胞融合，从而诱导g1、s、g2期细胞的染色质提前浓缩成染色体。形成的这种染色体称提前凝集的染色体（prematurely condensed chromosome，pcc）。这项技术已应用于细胞周期分析、正常细胞和肿瘤细胞染色体的微细结构的研究、多种因素作用细胞使染色体损伤及修复效应的研究，预测某种血液病的病程、预后及复发的临床实践等方面。实验用品1. 材料：人宫颈癌上皮细胞（hela

3、细胞）2. 器材：显微镜、离心机、水浴箱、吹风机、10 ml刻度离心管、5ml注射器、试管架、染色缸、吸水纸、擦镜纸、冰冻载玻片、记号笔、酒精灯。3. 试剂：50peg、hanks液（ph7.4）、rpmi-1640（含10灭活小牛血清，ph7.4）、10µg/ml秋水仙素、0.075m kcl低渗液、1/15m pbs、carnoy固定液、giemsa染液。实验内容及方法 一、收集培养的m期的hela细胞1. 向对数生长期的 hela细胞培养基中加入10µg/ml的秋水仙素，使终浓度为0.04µg/ml，在37二氧化碳培养箱内继续培养3小时，使大量生长

4、的细胞被阻断于m期。2. 取一瓶经上述处理的细胞，轻轻倾去培养液，加入5ml hanks液，反复进行水平振摇，使培养液不断冲刷细胞层（或用吸管吹打），m期细胞因变成球形容易脱离瓶壁而悬浮。将细胞悬液移入离心管中，计数备用。二、间期hele细胞的准备另取一瓶处于对数生长期的细胞，也可采用收集过m期细胞后的贴壁细胞，用0.25的胰蛋白酶消化23分钟，弃去消化液，加入5 ml hanks液，用吸管吹打成细胞悬液，计数备用。三、50peg的制备称取0.5g peg（mw4000），倒入离心管中，在酒精灯上加热使之融化，再加入预热的hanks液0.5 ml，混匀后放在37水浴中待用。四、细胞融合1. 将

5、 m期和间期 hela细胞按 11（各约为 106个）混合于离心管中，1 000rpm离心5min，弃上清液，用hanks液洗涤离心一次，再弃上清液，离心管倒置在滤纸上吸尽残液。2. 用弹指法弹散细胞，在37水浴条件下吸取0.5ml 50peg，逐滴加人离心管内，并不断轻轻摇动，整个过程约90秒钟，然后迅速加入5ml hanks液，以终止 peg的作用，在37水浴中静置 510分钟。然后以1 000rpm离心，去上清液，再用5ml hanks液洗涤，离心一次，充分去除peg。3. 弃去上清，加入2ml有血清的 rpmi-1640培养液，轻轻吹打成悬液，37水浴中温育3060分钟。pcc一般从融

6、合后10min开始，50min左右达到高峰。    五、制备pcc标本1. 细胞温育后，以1 000rpm离心5分钟，弃去上清夜，加入10ml kcl低渗液制成悬液，37处理3045分钟。2. 加入1 ml carnoy固定液进行预固定，1 000rpm离心8分钟，弃掉上清，弹散离心管底部细胞。3. 加10 ml carnoy固定液固定30分钟，1 000rpm离心5分钟，弃上清，留0.2 ml固定液。4. 用吸管吹打制成细胞悬液，取冰水载玻片滴片，吹风机烤干后，giemsa染色15分钟，流水冲洗，干燥后镜检。由于处于间期不同时相的细胞均能与m期细胞融合而被诱导产生pcc，因此，有三种不同形态特点的提前凝集染色体：g1期pcc、s期pcc、g2期pcc。其形态特点分别是：g1期pcc为细长的单线染色体，着色浅，呈蓬松的线团状；s期pcc由于染色体解旋，dna以多点进行复制，复制后的部分着色较深，以双线染