反义寡核苷酸抑制胆管癌细胞血管内皮生长因子基因表达的效应

1、    反义寡核苷酸抑制胆管癌细胞血管内皮 生长因子基因表达的效应        【摘要】目的探讨不同修饰的反义寡核苷酸(ODN)抑制胆管癌细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表达的效应。方法将4种不同修饰的反义VEGF ODN分别加入胆管癌细胞中，用RT-PCR及免疫组织化学技术检测胆管癌细胞中VEGF mRNA及蛋白表达，同时测定各上清液刺激血管内皮细胞生长的受抑情况。结果反义VEGF ODN

2、明显抑制胆管癌细胞VEGF基因及蛋白的表达，其中以硫代修饰的ODN3抑制作用最强，在10、20 mol/L ODN作用下，其抑制增殖效应为(0.690±0.016)，(0.688±0.010)。结论反义VEGF ODN有望成为胆管癌基因治疗的较理想药物之一。【关键词】胆管癌；反义寡核苷酸；血管内皮细胞生长因子 Inhibition of VEGF expression by antisense oligodeoxynucleotides in cholangiocarcinomaCHEN Rufu*, SUN Hongwu, TONG Yixin, et al.（*Depa

3、rtment of General Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030 China）【Abstract】ObjectiveThe inhibitory effects of four different modified antisense oligodeoxynucleotides (ODN) on VEGF mRNA expression were compared in cholangiocarcinoma to investigate the probability of developin

4、g new drugs of anti-angiogenesis. MethodsThe synthesized four deferent modified antisense ODNs were added to the medium of cholangiocarcinoma cells respectively. Expression of VGEF mRNA and protein were detected by RT-PCR and immunohistochemical staining. And the inhibitory effects of vascular endot

5、helial cell growth stimulated by the supernatants were determined. ResultExpression of VGEF mRNA and protein could be inhibited by VEGF antisense ODNs in cholangiocarcinoma. The thio-modified antisense ODN showed the most inhibitory effect. ConclusionIt is hopeful that VEGF antisense ODN may become

6、a new anti-angiogenesis therapy drug in cholangiocarcinoma.【Key word】Cholangiocarcinoma;Vascular endothelial growth factor;Antisense oligodeoxynucleotides血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前发现诱导肿瘤血管形成作用最强和最特异的生长因子，抑制肿瘤新生血管生成可阻止肿瘤的生长和转移1。鉴于VEGF基 因由8个外显子和7个内显子组成2，我们选择1，2外显子连接区和第3外显子单链设

7、计反义片段，用抗核酸酶解的硫代修饰的VEGF反义寡核苷酸与未修饰、非特异片段作对照，用RT-PCR技术观察稳定性对VEGF基因表达阻断的增强效应及比率，现报道如下。材料和方法1.材料：胆管癌细胞系(QBC939)由第三军医大学提供3，用含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养液培养，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)由中国典型物保藏中心提供，VEGF正义、反义引物、2-M正义、反义引物，反义VEGF寡核苷酸片段(ODN)由上海生工生物公司合成，Trizal(Promega公司)，兔抗人VEGF多克隆抗体(Santa Cruz公司)，PCR扩增仪为美国产PTC-150-160型。2.反义ODN的设计

8、和合成：分别设计互补于VEGFmRNA第1和2外显子连接区的ODN1和第3外显子的ODN2，对ODN2进行硫代修饰的为ODN3，另外合成一条非特异片段ODN4，结构如下：ODN1 TCCAGGGACCACTTGGCATGGTGGA，ODN2 GCAGTAGCTGCGCTGATAG，ODN3 GCAGTAGCTGCGCTGATAGTGC，ODN4 CGGGCCCATCGTCCACCCC。3.血管内皮细胞增殖抑制实验：QBC939在体积分数为15%胎牛血清的MDEM培养基中繁殖到一定数目，改换成无血清培养基，种植到24孔培养板上，每孔80 l,含细胞4×105个/ml。分别加入浓度为10

9、、20 mol/L的4种反义ODN，体积均为10 l，每24 h加1次，第48 h收集细胞上清液。将上清液80 l/孔加入96孔上的无血清培养的HUVEC中，细胞浓度为4×105个/ml，20 l/孔，72 h后收集该上皮细胞，MTT法检测血管内皮细胞生长受抑情况。4.反义ODN抑制胆管癌细胞VEGF mRNA水平表达： 将4×105个/ml的QBC939细胞加入24孔培养板中，2 ml/孔，再分别将不同剂量的ODN (10、20 mol/L)与QBC939细胞共培养48、72 h后收集细胞。异硫氰酸胍一步法抽提各细胞组中的总RNA。总RNA经紫外线分光光度定量， 琼脂糖凝

10、胶电泳鉴定。取3 g RNA用于逆转录。20 l反应体系包括： oligdt 0.1 g,RNasin 20 U, 2 mol/L dNTPs 4 l,AMV 5 U, 42 1 h， 95 5 min。2.5 l逆转录产物用于PCR。40 l总体积包括dNTP 10 mol/L，正义、 反义引物各为10 pmol, Tag 5U, VEGF正义引物5-TAGAATTCATATGGCACCGATGCCAGAACCAG-3，反义引物5-TAGGATCCTATTACCGCCTCGGCTTGTC-3。PCR反应条件为95 50 s，57 45 s，72 1 min，40个循环。2-M正义引物为5-A

11、CCCCCACTGAAAAAGATGA-3，反义引物为5-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3。PCR产物经2%琼脂凝胶电泳，溴化乙锭染色，通过凝胶扫描仪进行DNA电泳条带和光量子强度分析，将VEGF与2-M比值作为VEGF表达水平的参数，对VEGF PCR产物相对定量。5.反义ODN抑制胆管癌细胞VEGF蛋白水平表达：取少量细胞悬液，离心，取下层细胞均匀涂于粘附剂处理过的载玻片，自然干燥后，用丙酮固定5 min备用。LSAB法检测不同剂量及不同时间的4条ODN作用后的胆管癌细胞VEGF蛋白表达。结果1.ODN稳定性对抑制HUVEC增殖的不同效应：经反义ODN作用的上清液与HUVEC作

12、用72 h后，MTT检测结果显示，硫代修饰的反义ODN3对HUVEC增殖抑制作用最强，其次为ODN2，ODN1、特异片段ODN4及空白对照组则无明显抑制作用，见表1。表1组别10 mol/L ODN20 mol/L OPNODN10.786±0.020*0.790±0.025*ODN20.712±0.0200.708±0.025ODN30.690±0.0160.688±0.010ODN40.872±0.010*0.870±0.035*对照组0.686±0.0150.650±0.010 

13、    注：ODN3组与ODN1、ODN4比较，*P0.052.反义ODN对QBC939 VEGFmRNA表达的影响：4种反义ODN作用与胆管癌细胞48、72 h后，用RT-PCR方法检测VEGF mRNA表达，结果发现，硫代修饰的ODN3抑制效应最强，其次为ODN2、ODN1组、非特异片段和空白对照组VEGF表达强度最高。讨论反义寡核苷酸与mRNA杂交的部位有：5帽子端、5非翻译区、翻译起始区、编码区及3非翻译区。为了使ODN在体内保持结构稳定性，增加对核酸酶的抗性，我们采用了对寡核苷酸的磷酸二酯键骨架中磷原子硫代修饰方法，结果证实，经过硫代修饰的ODN3其抑制

14、胆管癌VEGF mRNA及蛋白的效应最强。为了减少其毒性和可能发生的非特异抑制，我们采用了减少硫代修饰数目的措施。本研究结果显示，2种ODN均能抑制细胞生长，但硫代反义ODN3抑制效应明显强于非修饰ODN2，其抑制效应24 h达到高峰，持续72 h，在96 h开始下降。这种反义寡核苷酸的时效作用对实验中体内肿瘤的治疗的给药间隔具有指导意义。作者单位：陈汝福（430030 武汉，同济医科大学附属同济医院普外科）童宜欣（430030 武汉，同济医科大学附属同济医院普外科）邹声泉（430030 武汉，同济医科大学附属同济医院普外科）孙宏武（湖北大冶特钢集团公司医院外科）参考文献1Maeda K,Chuhg YS,Ogawa HI, et al.Prognostic value of Vascular entothelial growth factor expression in