基于微流控芯片的小型流式细胞仪研究

1、浙江大学理学院硕士学位论文基于微流控芯片的小型流式细胞仪研究姓名：叶晓兰申请学位级别：硕士专业：分析化学指导教师：方群20080501浙江入学硕上学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝鎏盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文学名叶嗌乙签字吼硝年学位论文版权使用授权书月弓日本学位论文作者完全了解迸鎏盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向

2、国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿态堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名。叶战飙晰乡月乡日日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：导师签名：签字目邮编：电话：月留摘要随着微流控芯片加工技术逐渐普及和微流控分析方法研究的不断深入，微型全分析系统（，）已将分析实验室的部分功能转移到便携化的分析设备中，为化学分析设备的微型化与集成化提供了基础，最终可以实现分析实验室的“个性化、“家用化”，使分析仪器从化学实验室解放出来，进入千

3、家万户。本研究组在年提出了应用于微流控芯片的正交型激光诱导荧光检测光路新模式，具有光路结构简单，易于搭建的特点。该检测模式曾被用于构建微流控芯片流式细胞分析装置，该实验中，在荧光微球前向小角度（）方向上检测前向光强度的变化，实现了芯片上荧光微球的计数功能；利用芯片侧壁作为采集面，实现荧光微球荧光的同时采集。在上述工作基础上，本文进一步进行了正交光路激光诱导荧光检测一芯片流式细胞分析仪的小型化研究。该仪器具有仪器结构简单、体积小、试样消耗量少、价格低廉等优点。第一章，对流式细胞仪原理和基于微流控芯片的流式细胞仪的发展进行了综述。第二章，基于芯片正交光路检测模式，搭建了一套小型的微流控芯片流式细胞

4、仪。以小型半导体激光器作为激发光源，激光束被透镜聚焦于芯片通道中央，采用光电二极管检测芯片通道内流动细胞的前向散射光信号，采用小型光电倍增管检测荧光信号，整套仪器体积为（长度×宽度×高度），具有结构简单、体积小、价格低廉等特点。荧光检测系统对四甲基罗丹明异硫氰酸的检测限为，采用岬荧光微球作为模型样品考察了仪器的分析性能，同时初步实现了细胞样品的分析。关键词：微流控芯片，正交光路检测，流式细胞仪，（），（）（）一（），：，浙江大学硕士学位论文第一章微流控芯片上流式细胞仪的研究第一章微流控芯片上流式细胞仪的研究流式细胞仪的基本概念及工作原理流式细胞仪的发展凝结了半个世纪以来科学

5、家的心血和成果，是一项有多年历史的【，、发展迅速的生物医学分析技术【。年，提出了一个设想：使悬浮的单个血红细胞通过一根玻璃毛细管，用光电仪记录通过的细胞数量，他是世界上最早试图使细胞检测自动化的人。年，根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室，奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。年，在多年科学研究的基础上，利用效应生产了计数器。随后经、和等的不断努力，完成了计算机与仪器的物理连接及多参数数据的记录和分析，开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术，将流式细胞仪推向了临床方面。随着仪器和方法不断完善，人们将更多的精力投向样品的制备，细胞染色方法和软件开发等方面，从而扩大流式细胞仪的使用效果和应用范围

6、。流式细胞仪的概念与构造流式细胞仪（，）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等，基本结构见图。它作为测量细胞表面标记、形态特征、内部结构的精密仪器在实验室中得到了广泛的应用。流式细胞仪是以流式细胞术为理论基础，综合了光学、流体动力学、电子学和计算机控制技术的现代化医疗应用仪器【】。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。双。，掣”勰，！、二础岫圈流式细胞仪基本结构】流式细胞仪主要有四部分构成：激光源和光学系统；流动室和液流系统；检测系统；计算机和数据分析系统。其中流动室是仪器的核心部件

7、。（一）光源和光学系统激光是一种相干光源，能够提供高强度的照射光，稳定性强，发射角度小，能聚焦到细胞尺度，是细胞快速分析的理想光源。流式细胞仪是以氩离子激光器最为普遍，也有使用氪离子激光器或染料激光器的报道。经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测，因此，光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。光学系统包括各种透镜、滤光片、分光镜等，来自细胞的各种信号，如不同角度的散射光、不同波长的荧光等通过这些光学系统分别被送到不同的检测器。激光光束经透镜聚焦到检测区，聚焦得到的激光光斑直径应和细胞直径相浙江大学硕上学位论文第一章微流控芯片上流式细胞仪的研究近，这样可以使细胞得到

8、均匀照射，并且能够提高分辨率。聚焦光斑直径可由公式（）确定：（）其中，为光斑直径；伪透镜焦距；为激光束直径；九为激光波长。为了进一步提高荧光讯号的信噪比，在光路中使用了滤片，目前常用的滤光片可以分为三种：截止滤光片，带阻滤光片和带通滤光片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一波长区段的光线滤除或通过，如表示其允许通过波长范围为。（二）液流系统和流动室主要是由鞘液、细胞悬液和流动室组成。在气体压力的作用下，流动室内充满的鞘液从喷嘴喷出形成鞘液流，细胞悬液在鞘液流的夹带下和气体压力的作用下经导管输入流动室，正对流动室的喷嘴喷射。细胞悬液内的细胞在鞘液流的约束下排列成单列，由流动室的喷嘴喷出，成为细胞液

9、柱。（三）光电管和检测系统荧光染色的细胞经特定波长的光激发所产生的荧光，可通过光电转换器转变成电信号后进行测量，最常用光电转换器为光电倍增管（）。的响应时间短，仅为数量级；光谱响应特性好，在的光谱区，光量子产率都比较高。光电倍增管的增益从到可连续调节，因此对弱光测量十分有利。但是从输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞仪一般备有两类放大器：线性放大器，即输出信号辐度与输入信号成线性关系。适用范围：较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例如、测量等。对数放大器，输出信号和输入信号之间成常成对数关系。适用范围：免疫学，由于免疫分析时时常要同时显示阴性、阳性和强阳

10、性三个亚群，它们的荧光强度相差个数量级，用对数放大器采集数据易于解释。（四）计算机和数据分析系统浙大学碗掣论女第一章微疏拄片±漉武胞仪的”究放大后的电信号被送往计算机，再经模一数转换器传输到微机处理器进行处理，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，计算机把所测量到的各种信号进行处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。流式细胞仪的工作原理经荧光染色的细胞悬液由气压装置送入流动室，流动室由鞘流管和样品管组成，当鞘流液和样品流达到一定的压力时，鞘液裹挟着样品流迫使细胞有序地排列成单列，并以稳定的速度同方向经过岬

11、的喷嘴，从而确保细胞液流稳定，并且垂直通过激光聚焦区，图所示。图流式细胞仪鞘流图荧光标记的细胞经过激光聚焦区后，产生的信号以细胞为中心，向空间立体角发射（见圉），这些信号主要为以下几种：细胞前向散射光信号（，）、散射光信号（！，）和荧光信号（）。新：学“士学位论文第一章徽漉控片流式目胞倥的目究黑：嚣微帮”“”“”訾。种雹黜黼然。：椭。“，、÷：岫。；。甜。，“，汕图细胞信号图，一细胞的散射光信号是由细胞的反射、折射和衍射组成的，取决于细胞的大小、形状和密度等。前向角散射又被称为小角度散射光信号，角度为，与被测细胞直径的平方密切相关，对于同一种细胞群体，前向散射光强，则说明细胞体积比较

12、大，前向散射光弱，则表示细胞体积较小。细胞大角度散射光（跖茸，）信号，角度为。，所包含的信息较多，主要包括细胞表面和内部的精细结构以及细胞大小的信息。角散射光对细胞膜、细胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。细胞前向消光度信号是指当光束通过细胞后，在前向方向的能量降低，与细胞的本身吸光性质和散射有关。细胞的前向消光度信号可以反映细胞的体积、活性、胞质内物质含量（如蛋白质含量）等信息。细胞的荧光信号分析是流式细胞术中一个重要的组成部分，荧光强度和细胞内各种组分如、和蛋白质等的含量成正比，通过测定荧光强度就可以知道细胞内各组分的含量。荧光信号有两种一种是细胞本身的荧光

13、信号，即在激光照射下发出微弱的荧光信号；第二种是经荧光物质标记后的细胞在激光照射下发出特异性的荧光信号，即选择不同的荧光染料试剂与细胞膜表面抗原、受体或膜蛋白特异性结合，或穿透细胞膜与胞质内物质结合，在一定波长浙江大学硕士学位论文第一章微流控芯片上流式细胞仪的研究的激光照射细胞后，这些与抗原、蛋白或其它物质结合的染料就会发出荧光信号。利用这些荧光信号可以对标记的特异性物质进行定性和定量分析，从而实现对细胞亚群功能的测定。以上产生的散射信号和荧光信号可以通过一些滤光片分辨开。散射光是从细胞表面或者细胞内颗粒散射出来的原激发光谱，其信号较强，用光电二极管即可检测，但是荧光信号较弱，必须用光电倍增管

14、（）才可检测。流式细胞仪的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。喷嘴射出的液流柱在流动室的压电晶体发出几十的电信号作用下发生振动，断裂形成均匀的液滴，待测定细胞分散在这些液滴之中，一般液滴间距约数百。振荡信号频率由实验公式（）确定：（）其中是液流速度，为喷孔直径。根据选定的某个参数由逻辑电路判明细胞是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中，充电电压一般选或，偏转板间的电位差为数千伏。使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间，精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，可根据具体要

15、求进行适当调整。图为传统流式细胞仪的细胞分选过程。尊，酗传统流式细胞仪分选过利流式细胞仪的应用流式细胞术相对于其它细胞分析技术，具有以个优点：）高分析速度，每秒可检测分析个细胞。）高分选速度，精度可达以上。）高荧光灵敏度，能够区分仅有差别的两个细胞。）多参数检测。因此，基于流式细胞术的流式细胞仪在细胞生物学，免疫学，肿瘤学等方面有着极其广泛的应用。，和细胞周期的分析随着流式细胞仪在临床肿瘤病中的应用，测定细胞含量的异常增加，对于肿瘤的诊断具有结论性的意义。肿瘤细胞有其特定的细胞周期，利用流式细胞仪测定细胞周期内各个时期的动力学参数，借以揭示肿瘤细胞的生物学特点，作为指导肿瘤治疗、病症发展过程、

16、预后等的参数。人体正常的体细胞应该有比较稳定的二倍体含量，但细胞发生癌变的过程中，细胞的含量会发生异常改变，出现非整倍体。流式细胞仪能够测出含量的改变，然后将细胞群体的各个荧光强度绘制成图，从而显示细胞的相对含量。测量的含量可用于血液中的网织红细胞的检测和计数。网织红细胞是从骨髓最新释放到外周血的成熟红细胞的前体，它的数目是反映红细胞造血功能的重要指标。淋巴细胞亚群分析淋巴细胞具有表面特异性抗原差异，这些不同抗原表现型的亚群执行不同的机能，当亚群之间的比例失调时，人体已经受到疾病的侵害。在流式细胞仪上结合免疫荧光方法，可以辨别和计数带有不同表面特异性抗原的淋巴细胞，对于机体的细胞免疫状况提供了

17、依据。通过检查血液中的含量，可以检测艾滋病。艾滋病是一种由人类淋巴细胞病毒（）感染而造成的疾病，该病毒主要侵袭淋巴细胞，在临床上表现为，外周血中细胞减少，并且在淋巴细胞中所占的比例下降。细胞受体的分析受体研究是当代医学研究的热点，因为许多生物的活性物质需要通过细胞受体起作用。通过对细胞表面受体（如转铁蛋白受体、低密度脂类受体、淋巴因子受体等）进行定性定量分析，有助于对许多疾病进行确诊，如肿瘤、冠心病、内分泌疾病等。其它方面应用流式细胞仪的其它应用还包括：诊断和治疗白血病；研究和诊断获得性或先天性缺陷病；血液中大肠杆菌等。微流控芯片流式细胞分析系统的研究进展传统的流式细胞仪虽已实现商品化，但仍存

18、在仪器体积大、结构复杂、造价高等局限性，所以对流式细胞仪改进已迫在眉睫。微流控芯片所具有的特点，使其最有可能应用到流式细胞分析，从而降低成本和体积。具体包括：微流控芯片上岬级的通道结构与生物细胞尺度上相容。微流控芯片网络式二维或三维通道结构较易实现单个细胞进样与控制。微流控芯片微通道中利用流体动力、气压、重力、电压等多种手段，可以简化单细胞计数、筛选、胞内分析等过程。微流控芯片微加工技术，可以将多个部件和功能集成到同一个芯片上，较易制成功能齐全的便携式仪器。因此，微流控芯片用于流式细胞分析是近年来该技术发展的热点之一，自等【】首次建立微流控流式细胞仪以来，国内外研究者不断将光散射法，荧光标记法

19、，阻抗变化等方法应用到芯片流式细胞分析中。基于微流控芯片的流式计数方法库尔特技术库尔特（）技术通过测量电阻变化进行微粒计数，当细胞通过小孔引起电阻的变化时，电路电流中将会产生一个脉冲，脉冲越大，表示通过的细胞体积越大，就可以对细胞进行计数和分选。年，等【】研制出了一套基于微流控芯片的库尔特粒子计数器。如图所示，该装置中有股溶液，最中间为样品液，靠近样品液的股液体为电解液，可以起到鞘流作用；最外层的股液体为非电解液，具有动态调节鞘流有效宽度的能力。样品液中的微粒在股电解液的作用下逐个通过中间狭小的区域，从而引起出口处电阻的变化。：曲：健：，图微流控芯片库尔特计数器¨年，等在库尔特计数技

20、术基础上，利用正弦交流阻抗方法，发展了一个微流控芯片细胞计数装置。检测细胞频率达，能区分微粒的体积。图是模拟微流控芯片通道中细胞流动造成电阻变化，为三个电极，之间的电阻与之间的电阻差值，即为细胞的电阻。该仪器还处于初步测试阶段，还有许多部分需要进一步完善。图币微流控芯片细胞计数器浙江人学颐学位论文第一章微流拄流式细胞仪的研究年，等将阻抗变化的检测进一步应用到细胞计数。如图所示，微流控芯片通道内集成了聚合电解质盐桥电极，可以检测流经细胞的电阻变化，从而完成细胞计数，且能辨别细胞的体积。图基于聚合电解质盐桥的流式细胞分析系统“。“。”蜘“。：兰：；：”。“。”咖“”“。“”一检测细胞光散射和荧光技

21、术利用光散射法和荧光标记法检测微粒或细胞，是流式细胞计数最常用的技术。将荧光染色的细胞排成单列通过微通道，用激光照射通过的单细胞，将发出的瞬间散射光和荧光转换成电信号，最后用计算机进行处理，进行细胞的计数和分选。年，等报道了一种基于简单微流控十字通道芯片的流式细胞分析系统。如图所示，系统中使用的氲离子激光器，以电渗流方法对细胞或荧光微球进行鞘流驱动，当细胞或荧光微球通过检测区时，发出的散射光和荧光，都由同一个目镜接收，再使用二向色镜将散射光和荧光分开，分别由不同的光电倍增管检测。如图所示。撕等”在微流控蕊片通道内覆盖一层聚基硅氧烷（），防止细胞贴壁，如图一所示，在电渗流作用下，对细胞进行散射光

22、和荧光检测。撕学明学论空第一微“。拧：式胞住的研究图简单十字芯片的鞘流圈自】图用于细胞计数的微流控芯片等”研制了一套检测细胞内片段的流式细胞分析仪（图）。实验中分别使用绿光激发的一和红光激发的染细胞，在各自的激光激发下，细胞发出的荧光由不同的雪崩二极管接收。由染色的细胞得到的荧光信号强度，可以反映出整个细胞的长度；染色的细胞荧光信号能够反映特殊的长度。仪器的灵敏度可达到单分子水平，对单个分子的信噪比为。图检测片段的流式细胞仪一“”浙人学硎学位论文第章馓控¨：“式女胞仪的宄等【“对基于微流控芯片的多角度散射光进行了研究。该仪器在。和。两个方向上检测散射光，利用这两个散射光的信号，可以进

23、行微粒的计数和体积大小的分辨。如图所示，微粒在真空泵和夹流液的作用下，逛个通过激光斑点处，发出散射光信号，并使用光电倍增管在。和。方向检测散射光，用于进一步的分析。该研究组不仅将该仪器应用到荧光微球的计数和体积大小的分析，而且还应用于反应蛋白含量的分析，用于急性炎症、组织损伤、心肌梗塞、心脏病等疾病的研究。图（）仪器结构图（）仪器实际照片（）等【”提出了一套集成化的流式细胞计数装置，在芯片通道处植入光纤接收细胞散射信号。图所示，计算机控制的注射泵调整鞘流流速，使得细胞通过激光聚焦点，由雪崩二极管接收散射光信号，最后可以测定不同细胞的体积。年该研究组”报道了基于微流控技术的流式细胞仪，该仪器集细

24、胞计数和分选功能于一体，如图所示。在芯片上实现了细胞两层鞘流结构，增强了细胞计数能力。细胞通过各自鞘流区的检测点时，由高分辨率的摄像机采浙大学顺学位论文第帝融流挡芯片：洫武日仪究集信号。陔研究组进行了细胞训数，井计算了细胞在各自鞘流通道中的速度。见外，在芯片下游通道内安胃了乜极，利用电撒产。的负介电电泳作用，对血细胞进行分选。幽微流控芯片流式细胞计数装置粪。压渴妒声等忑三引；！巨；巨訇叵习一二苫二酗流式细胞仪两层鞘流结构图卸浙学碰岸位论文第一章徽拉”：流式自¨胞仪的研究年，￥¨成功地研制出了高效且不损害细胞的流式细胞分析仪，可对较少量珍贵细胞进行分析。如图所示，泵位于计算机

25、控制的盲文显示器处，能够精确调整液体流速。采用芯片，并在微通道处增加扩散装置，以减小泵产生的影响。样品液池为夹角为。的圆锥形结构，位于泵的前面，可以减小使用过程中对细胞的机械损害。采用荧光微球检测仪器的分析性能，分析了经探针染色的细胞周期，并进行了细胞计数，速度为埘。圉芯片二维通道结构也”艾滋病是人类近代医学史上最引起人们关注和最使人恐惧的一种疾病，世界卫生组织将每年的月日定为世界艾滋病日。在发展中国家，已经有万人感染了艾滋病，每天有个新的感染者，各个国家都在采取有效措施降低感染率。采用高效、简便、低廉的方法检测病毒，已是一个迫切需要解决的问题。等【“利用色谱法进行早期测试。在微流控芯片通道内

26、固定上单克隆抗体，当血液流到通道内，淋巴细胞和单核细胞固定在通道表面，通过加入不同的染料区别这两种细胞，在倒置显微镜下显示绿色荧光的为淋巴浙学顿±学论文第一章微流控芯片流式日胞位的研究细胞，从而得到淋巴细胞数目，如图所示。这个仪器的优点是，直接测定手指处的血液，不用进行预处理；但是该仪器不能进行大量细胞的分析。卫毛图计数仪瑚等提出了一种新型的技术，即在芯片上检测淋巴细胞的数目和百分率。该仪器使用金属氧化物半导体场效应晶体管检测细胞的数目，淋巴细胞经过检测区时引起电路中电压的变化，从而导致仪器中漏电流信号变化，产生信号脉冲，并且脉冲的高度与细胞的体积成正比：用光电倍增管收集荧光信号。实

27、验装置如图卜。利用该仪器检测到的淋巴细胞数目以及百分率，与传统流式细胞仪检测到的结果相似。该仪器的缺点是检测速度较慢，为心浙江大学硕士学位论文第一章微流控芯片上流式细胞仪的研究图实验装置图微流控流式细胞仪中单细胞操作方法目前对单细胞的操控技术有以下几种，如液压驱动，聚焦激光捕获，电渗流操纵，介电电泳捕获等。利用上述方法，可使细胞进入激光检测区，而且多种操控技术可以相结合实现细胞分选。液压驱动即重力驱动，由于样品池和废液池之间存在液位差，并且可以调整液位差，改变细胞流动速度，实现细胞的流动进样。等【】利用重力作用将细胞夹流进入检测区，这种方法可以减小细胞的损失，实验中采用激光器。如图所示，检测到

28、的荧光信号反馈到计算机，然后由计算机控制泵的开关来实现细胞的分选。实验中利用该仪器对荧光微球和鸡血细胞进行分选，分析速度达。队学埘位论空第十礅托“胞日圈荧光分选系统结构生口年，罗国安等口”研制出了一套荧光分选微流控流式细胞仪（结构如图）。该仪器是以传统的共聚焦光路为基础（图，）。细胞在重力的作用下，逐个进入检测区，利用电渗流进行细胞分选，活性细胞通过检测区时，细胞自身的负电，使得活性细胞进入收集通道：非活性细胞发出的荧光信号，经光学系统检测反馈到电压控制系统，从而作用于检测区的电场停止，非活性细胞进入中间通道，如图，。为了防止凋亡细胞在玻璃通道上贴壁，实验中加入了定量的羟丙基甲基纤维素提高了系

29、统的可靠性。第一帝馓流撺”施位帕¨究哆默擞叶“咛圉（）荧光分选微流控流式细胞仪结构，（）芯片微通道（）：，（）：”利用激光捕获作用力原理，将光聚焦到细胞上，由于细胞对光有反射、折射和吸收作用，光的动量发生改变，从而使得细胞获得了动量，即光对细胞产生了一个作用力，所谓“光压”。等利用激光捕获（光镊）技术对细胞进行了分选，如图所示。细胞在重力作用下进入荧光检测区，用观测经过的细胞。未染色的细胞流入废液区，染色的细胞在光镊作用下被收集，从而实现了细胞的分选。这种方法灵敏度高，但不适用于多种细胞的分选。第章微流柠剐，目吣仪的究图光镊流式细胞分选系统，：系统结构示意蹦：芯片分选结构图盯：电渗流

30、驱动原理，在为中性或碱性的条件下，玻璃通道表面携带负电，与通道相邻的液体部分携带正电，从而形成双电层。在通道两侧施加电压，带正电的电层在电场作用下，发生移动，从而带动整体液流流动产生电渗流。等口”采用多层软光刻方法，研制出了集成化的细胞分选器，结构如图所示。仪器逆分选细胞过程分为三个阶段：缺省模式，逆转模式复原模式。当仪器检测到所需的细胞时，进入逆转模式，即改变逆转泵的频率，细胞慢慢回到检测区，重新检测，然后关闭所有的转换阀，通道里的溶液停止流动，开启分析闽，细胞进入分选通道，完成细胞分选。该仪器具有以下优点；对细胞损害小，仪器价格便宜，易操纵，缺点：通量低。浙江大学硕士学位论文第一章微流控芯

31、片上流式细胞仪的研究图集成化细胞分选仪结构图介电电泳作用是，细胞在非均匀的交流电场中被极化，产生偶极距而在电场中移动，若细胞电泳方向和其它作用力（如重力）方向相反，可以静止在任何位置【。由于细胞介电特性、导电率、体积大小不同等，细胞产生的偶极距也不一样【，当细胞的极性程度高于溶液时，介电电泳力随着电场尺度增加，称为正介电电泳；反之为负介电电泳【翻。等【刎介绍了一种能自动分选细胞和细胞核的芯片，该芯片集成了微泵微阀，利用介电电泳作用实现了细胞的分选（如图）。集成芯片大小为。实验中，对具有活性和非活性的细胞进行了分选，如图所示，在正介电电泳的作用下，活性细胞吸附到微电极表面，非活性细胞被分选到非活

32、性细胞槽中，等到非活性细胞分选完成后，停止供给介电电泳的电压，活性细胞被释放，微泵开始作用，活性细胞分选到另一个通道中。另外，可以在通道中加入破膜剂，使用上面的方法，实现细胞核的分选。该芯片可以实现个细胞样品的分选。浙江大学硕上学位论文第一章微流控芯片上流式细胞仪的研究一一、匹，翌。毒淞伽涵它菇尹、图集成化芯片结构图一一弓。一：李匹巴一一图介电电泳作用示意图等】利用介电电泳开关把细胞分选到五个通道中，进一步实现了分选系统的多通道化。在芯片侧壁处放置十字交叉电极，产生非均匀的交流电场，使得细胞或微球等微粒受到负介电电泳力而移动。如图所示，该仪器将微粒分选到不同通道，实验过程中，省略了常用的微粒夹

33、流过程，只需改变两侧电极的电压，微粒在通道中受力发生了变化，微粒的流动方向也发生了变化，从而实现了细胞的分选。￥论弟章触拄：胞倥的究。徭至翟瞠篮睡髓群！、，。瞄，圈基矗二！二：图介电电泳细胞分选过程吼小型微流控流式细胞仪的发展随着微流控芯片上的流式细胞分析研究的不断深入国内外的研究组开始研制集成化的微流控芯片流式细胞仪这为流式细胞仪的小型化提供了基础。等口”研制出便携式的流式细胞分析系统采用一次性的芯片，如图所示，当细胞流经点时，在，两侧鞘流液作用下，逐个通过检测点，发出的荧光由雪崩二极管接收并反馈到计算机，当寻找到合适的细胞时，计算机便会自动丌启和处泵阀，进行细胞分选。幽一单细胞分选芯片上的

34、流体模型一年，等【研制出一套基于微流控：卷片的微型流式细胞仪，将光纤集成到芯片壁上，如图所示。氦氖激光器发出的红色激光，经集成在芯片壁上的透镜聚焦到通道中，微球在激光作用下发出散射光，检测光纤在特定的角度处检测前向散射光和侧向散射光，进行微球计数（图）。但是该仪器中光损耗太大，不利于进一步小型化。削微“流式细胞仪的结构图】浙江大学倾学位论第微流挣芯¨漉，胞怔呻究】。¨一一曲一？主誊图光纤连接部位的通道图等研制出了基于光波导原理的细胞计数仪，能够多角度检测细胞散射光，该仪器的光波导核心部分是液体通道。如图所示，激光束从棱镜处入射到芯片通道内，遇到细胞后发出散射光。发出的散射光

35、由半球形透镜接收，入射到进行检测。半球形透镜可以接收来自通道内。的散射光。实验中，以直径为和的荧光微球模拟细胞进入芯片通道，检测侧向散射光，得出侧向散射光信号与微球的体积成比例，实验还发现荧光微球的位置会严重影响散射光的发射模式。图基于波导细胞计数仪的原理图【】第一市礅流控武胞仪的宄年，等通过在芯片上微泵，成功的研制出一台小型流式细胞仪。如图所示，芯片入口处的微泵提供细胞鞘流所需的驱动力。出口处的微泵在反馈的荧光信号控制下，可以进行细胞的分选。仪器采用的激光器，能够减小仪器的体积。该仪器的优点是体积小，重量为。缺点是检测速度慢，仅为；：占片加工过程复杂。卜“？茹“口争紧一一一”卜曰囡图芯片的结构示意图等”利用介电电泳作用，设计一套小型的细胞分析装置（图）。该仪器由三部分组成：液体进口处泵管，细胞分离区，细胞分选通道。细胞分离区是一个具有独特形状，且电场力分布不均匀的区域，此区域由一系列微电极控制，细胞在微电极控制的芯片通道中受到不同的介电电泳作用力，从而实现细胞的分离。以酵母细胞为研究对象，在泵的作用下，将酵母细胞和缓冲液按一定比例夹流进入分离区。活细胞与非活性细胞由于介电特性等的不同，受到不同介电电泳力，细胞偏转到不同通道，从而实现分选。该仪器通过控制暑曰浙人学硕学位论立第一章微流控芯片漉武细胞