周围神经缺血后相关神经元凋亡及神经生长因子动态变化的研究

1、周围神经缺血后相关神经元凋亡及神经生长因子动态变化的研究【摘要】 目的 探讨大鼠坐骨神经缺血后相关脊髓节段和背根节神经元的凋亡及神经生长因子（ngf）表达的变化，以期为周围神经缺血性神经病的机制及临床治疗提供理论依据。方法 结扎大鼠单侧髂总动脉制作坐骨神经缺血模型，分别于术后3、5、7、14、21、28 d用4%多聚甲醛灌流固定，取腰髓l46节段和双侧第46腰脊神经节固定，分别进行免疫组织化学及tunel染色检测神经元的ngf和凋亡表达,同体对照。结果 坐骨神经缺血的不同时间段l46脊髓前角运动神经元及背根节神经元可见凋亡神经元细胞，背根节神经元凋亡率术后3 d时显著性升高，术后7 d时达到峰

2、值后缓慢下降，后期接近对照侧水平。腰髓前角运动神经元在术后5 d时开始有显著性提高，14 d时达到最大值后逐渐下降，后期较对照侧仍显著性增高。腰髓前角运动神经元及背根节神经元ngf的表达5 d时阳性率较对照侧开始显著降低，7 d时达到最低点后逐渐复原，至术后28 d时与对照侧无明显差异。结论 周围神经缺血性损伤导致相关神经元胞体中ngf含量减少，与神经元凋亡相关。缺血性损伤对背根节感觉神经元的影响较脊髓运动神经明显。【关键词】 大鼠 坐骨神经 神经元 缺血 凋亡 ngf有研究表明，周围神经损伤将不可避免引起相应节段脊髓和背根节神经元的死亡，凋亡是受损神经元死亡的重要形式之一1-4。神经营养因子

3、不仅对神经细胞有促进生长发育的功能，而且对损伤的神经细胞也有保护、预防变性和促进再生的功能。周围神经缺血可导致缺血神经纤维变性，轴突运输速度减慢或停止，相关神经元胞体逆行性变性5，6。周围神经缺血所致相关神经元胞体变性或死亡，是否由于神经元胞体摄取某种神经营养因子不足而导致其程序化死亡，笔者尚未见有报道证明。本研究通过建立周围神经缺血模型，观察缺血神经相应脊髓节段前角运动神经元及背根节神经元内神经生长因子（ngf）的表达变化及神经元在不同时期凋亡表达的变化，分析其相互变化的关系，为探索临床缺血性神经病的机制、预后和治疗提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 动物分组及模型制备 选用成年健康wi

4、star大鼠(河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证号04057)30只，雌雄不限，体重200250 g，按手术先后随机分为3、5、7、14、21、28 d共6组，每组5只。随机选择动物的一侧为实验侧，另一侧为对照侧。用2%苯巴比妥（100 mg/kg）作腹腔麻醉，腹部剃毛，无菌操作下取中腹正中切口或旁正中切口进腹，显露实验侧髂总动脉，双重结扎，造成实验侧坐骨神经缺血。逐层缝合腹部切口，消毒，动物清醒后分笼，常规饲养。实验动物分别于术后不同时间组，以10%乌拉坦（1g/kg）行腹腔麻醉，开胸，升主动脉插管，用0.9%氯化钠溶液快速灌流， 4%多聚甲醛0.1 moll、pbs固定液（ph值7.

5、4）300 ml灌注固定。经后入路取与坐骨神经相关的l46节段和双侧第46腰脊神经节，置于同样固定液中，固定24 h，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，厚度为5 m，每隔20张取4张分别贴于涂有apes的载玻片上，以此法每组标本收集4套切片烤干备用。 1.2 试剂来源 ngf抗体，sp试剂盒，原位细胞凋亡检测试剂盒，dab显色剂，胰酶消化液均购于北京中山生物技术有限公司（santa cruze biotechnology 公司产品）。 1.3 免疫组化染色步骤 石蜡切片常规脱蜡至水,用pbs（0.01 moll，ph值7.4）浸泡冲洗3次, 3%过氧化氢甲醇液，室温下孵育30

6、min以消除内源性过氧化物酶的活性,3%正常羊血清封闭1 h(37)，滴加稀释后（1100）的一抗ngf（兔igg多抗），4冰箱湿盒内过夜（20 h），滴加生物素标记的二抗（羊抗兔igg），37恒温箱湿盒内孵育30 min。 滴加辣根过氧化物酶标记的链卵白素工作液，37恒温箱湿盒内孵育30 min，dab显色，苏木精复染。常规脱水、透明、中性树胶封固。在光学显微镜下观察，计数各组手术侧阳性前角运动神经元数量。 1.4 原位末端标记技术（tunel法）检测细胞凋亡 操作过程：切片用二甲苯常规脱蜡，用蛋白酶k（20 g/ml）消化，滴平衡缓冲液，37恒温箱湿盒内孵育30 min，滴加tunel反应

7、混合物，37恒温箱湿盒内孵育60 min。滴加辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体（转化剂pod），37恒温箱湿盒内孵育30 min。 dab显色，苏木精复染。冲洗、透明、封片。阴性对照以pbs替代tunel反应混合物。阳性对照先用dna酶作用，再行上述操作。镜下观察标记的阳性细胞。 1.5 细胞计数 腰髓前角运动神经元及背根神经节神经元计数在显微镜200倍下进行，各时间组的标本，每个标本计数10张切片，计数阳性细胞及总细胞数，计算免疫反应阳性细胞的百分率及凋亡百分率。设缺血与否，缺血时间，细胞因子。 1.6 统计学分析 应用spss 13.0统计软件，计量资料以s表示，采用对结果进行析因设计的方

8、差分析，分析时间与缺血之间的交互作用，用duncan 法作缺血情况下不同时间组均数间的比较，采用双侧检验，p0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 tunel法检测神经元凋亡的结果 实验侧腰髓前角运动神经元于术后3 d时无明显变化，5 d时凋亡率显著升高，于术后14 d神经元细胞的凋亡率达到峰值后随时间进展逐渐降低，至术后28 d时仍高于对照侧。实验侧背根节神经元于术后3 d时阳性率比对照侧显著性升高，术后7 d时达到峰值后随时间逐渐降低，至术后28 d时与对照侧无显著性差异，背根节神经元凋亡率升高幅度较腰髓明显。凋亡的神经元在背根节中多散在分布于周边部分，在腰髓前角中散在分布。凋亡神

9、经元胞体肿胀或缩小，细胞核致密，偏位，呈棕黄色或深黄色，部分神经元固缩、变小呈三角形。术后对照侧腰髓前角运动神经元及背根节神经元罕有阳性表达。 析因方差分析结果显示，fa= 438.109，fb= 62.859，fab= 438.109，p0.01，在背根节fa= 669.873，fb= 60.864，fab= 54.080，p0.01，说明实验侧腰髓前角运动神经元及背根节神经元凋亡率的表达与对照侧是不同的，缺血后不同时间的表达亦不相同，缺血情况与时间对神经元凋亡的表碉有交互作用（实验侧不同时间腰髓前角神经元及背根节神经元的凋亡率及不同时间组相互间两两比较结果见表14，图1、2)。表1 2侧不

10、同时间腰髓前角神经元神经元的凋亡率比较表2 实验侧不同时间组腰髓前角神经元神经元的凋亡率两两比较结果 注：*p0.05，#p0.01 2.2 ngf免疫组织化学染色结果 实验侧的腰髓前角运动神经元ngf表达阳性率在术后3 d时无显著性变化,术后5 d时与对照侧比较开始有显著性降低, 随缺血时间的延长降低程度增大，术后7 d时达最低点，后逐渐回升，术后28 d时阳性率接近对照侧。背根节神经元ngf表达阳性率变化趋势与腰髓前角运动神经元相同，但背根节神经元ngf阳性表达率降低幅度较腰髓前角运动神经元明显。表3 2侧不同时间腰髓背根节神经元的凋亡率比较表4 实验侧不同时间腰髓背根节神经元凋亡率比较注

11、：*p0.05，#p0.01 免疫组化染色阳性的细胞多为中、小型神经元。免疫反应物质呈棕黄色颗粒状，弥漫分布于胞浆中，大小不等，细胞核染色结果为阴性，核仁无阳性染色，部分神经髓鞘着色。各实验组对照侧神经元形态正常，大小细胞均可见免疫反应性染色，实验侧部分神经元胞体肿胀，核偏位。表5 坐骨神经缺血后腰髓前角运动神经元ngf的阳性表达结果 析因方差分析结果显示，在腰髓fa=144.258，fb=16.916，fab= 14.635，p0.01，在背根节fa= 307.249，fb= 41.462，fab= 33.454，p0.01，说明实验侧腰髓前角神经元及背根节神经元ngf的表达与对照侧是不同的

12、，实验侧不同时间ngf的表达亦不相同，缺血情况与时间对ngf的表达存在交互作用（缺血情况下不同时间腰髓前角运动神经元及背根节神经元ngf的表达阳性率及不同时间组比较结果见表58，图3、4。表6 实验侧不同时间组腰髓前角运动神经元ngf的表达阳性率比较结果表7 坐骨神经缺血后腰髓l46背根节神经元ngf的阳性表达表8 实验侧不同时间组腰髓l46 背根节神经元ngf的表达阳性率两两比较结果 3 讨论 细胞凋亡是神经元死亡的基本形式。发育过程中的神经元是否与外界靶器官有接触，是否建立了神经调控通路，是决定神经元是否发生凋亡的一种重要原因。切断成年大鼠的坐骨神经的实验中，可在腰髓前角运动神经元和背根节

13、神经元中见到凋亡细胞，感觉神经元死亡占29%，运动神经元死亡占41%7-10。实验表明，坐骨神经外血管系的缺血可以引起其相关腰髓节段和背根节部分神经元胞体超微结构的变化，术后714 d时变化明显，核周粗面内质网扩张，排列紊乱，线粒体肿胀、嵴断裂，数目减少，变形严重的核膜溶解、破裂，细胞体积缩小11。细胞器的减少及其病理变化，使神经元处于低功能状态，不能合成充分的营养物质供轴突修复再生需要。神经元超微结构变化的结果与用原位tunel标记染色结果变化相互吻合。背根节神经元早期凋亡表达率即明显升高,术后7 d时达峰值，后逐渐缓慢下降接近对照侧水平。腰髓前角运动神经元在早期凋亡表达率开始显著升高，术后

14、14 d时达到峰值，后逐渐缓慢下降，术后28 d时仍较对照侧显著性升高。说明腰髓节段前角运动神经元出现损伤表现的时间较背根节神经元晚，但损伤持续的时间长，损伤呈渐进性。背根节神经元凋亡表达率增高幅度大，神经元丢失较多，说明缺血性损伤对背根节神经元影响大，本研究结果与临床上缺血性神经病的表现相符，早期出现感觉障碍，症状持续时间长，感觉功能难以恢复。 ngf为靶源性神经营养因子，逆行沿轴突运输至神经元胞体发挥对神经元的作用12-17。神经元在创伤后接受ngf受体介导的ngf的营养支持作用，维持神经元的生存和轴突的再生。我们的实验表明，周围神经缺血后，其相关的腰髓前角运动神经元和背根节神经元胞体中n

15、gf表达阳性率降低，早期降低不明显，可能是轴突损伤程度较轻，神经元尚可从周围组织及靶器官得到足够的ngf，术后5 d时ngf表达量开始显著性降低，7 d时达到最低值，说明随缺血时间的延长轴突的损伤程度逐渐加重，神经元能够获得的ngf含量逐渐减少，背根节神经元中ngf表达阳性率较腰髓前角神经元下降明显，说明背根节神经元较脊髓前角神经元易受损，此结果与临床感觉神经的易损性相一致。 在切断坐骨神经的实验中，断端给予神经营养因子可减少神经元的凋亡，再生轴突数目增多18。周围神经缺血后缺血部位在神经纤维而不在神经元胞体，神经元胞体发生凋亡与缺血后神经纤维轴突损伤引起的神经元胞体生存所需的营养物质减少，特

16、别是神经营养因子的减少有密切相关，凋亡细胞量的多少与神经营养因子量的多少密切相关。缺血损伤后ngf在神经元中的表达主要表现为减少，腰髓前角运动神经元和背根节神经元凋亡的高峰期与其ngf表达的最低时段相符合，说明ngf对神经元正常形态、功能、生化代谢和生存有重要意义。脊髓前角运动神经元的凋亡率较低与脊髓前角运动神经元同其他神经元及组织联系广泛，轴树突较多，相互间关联密切有关。背根节神经元凋亡率高说明感觉神经元有易损性，感觉神经元中神经营养因子的来源对靶器官的依赖性较大。 临床上由各种因素造成引起周围神经缺血的疾病较多，短时间内出现神经传导功能障碍，所支配的肢体感觉减退，肌张力减弱，当传导功能完全丧失则支配区感觉完全丧失。受累的部位运动、感觉功能障碍，其程度与缺血程度相平行，大多预后较差。神经功能的恢复涉及到神经元轴突几效应器。神经元的凋亡，数量的减少将影响神经的再生。因此在缺血损伤的早期如何保护好神经元是一项十分重要的课题，将对临床缺血性神经病治疗和预后有重要的意义。【参考文献】 1 kerr jf，wyllie all，curriear. apoptosis: a basic biological ph