基于荧光标记核酸探针及核酸染料

1、DOI :10.3724/SP.J.1096.2013.20603基于荧光标记核酸探针及核酸染料SYBR Green定量检测单链DNA郑爱华1,2朱庆2向东山2何治柯*21(湖北医药学院公共管理学院,十堰4442002(武汉大学化学与分子科学学院,生物医学分析化学教育部重点实验室,武汉430072摘要建立了同步双色荧光定量检测单链DNA 的方法利用氧化石墨烯将荧光标记核酸探针的荧光猝灭,而当其与待测液中的目标DNA 发生杂交反应,生成的双链DNA 脱离氧化石墨烯而使得染料荧光得以恢复,同时生成的双链DNA 与核酸染料SYBR Green 结合,使荧光增强在优化条件下,目标DNA 浓度在110-

2、10210-9mol/L 范围内时,两种荧光染料的荧光强度之和与目标DNA 的浓度之间具有良好的线性关系,拟合的回归方程为y =63.388x +9.3862,R 2=0.9954,检出限为85pmol/L 本方法灵敏度高准确性及选择性好关键词氧化石墨烯;SYBR Green ;同步双色荧光谱;单链DNA ;定量检测20120611收稿;20121130接受本文系国家自然科学基金(No.21075093资助项目*E mail:zhkhe1引言DNA 的检测方法很多,常见的方法有光谱分析电化学分析及生物学分析等18在光谱分析中,荧光法具有操作简单检测快速灵敏度高和选择好等优点812,是定量检测D

3、NA 应用最广泛的方法之一氧化石墨烯(GO 是一种单层的二维的碳纳米材料它具有很多独特的优点,如优良的电子机械导热和力学性能,以及在室温下具有较高的电子迁移率,因而备受关注和重视GO 能吸附单链DNA 和芳香族化合物,对标记在单链核酸上的荧光染料的荧光具有很强的猝灭作用当目标DNA 存在时,目标DNA 与荧光染料标记的DNA 杂交形成双链,与氧化石墨烯的作用力减弱,使得探针上标记的荧光染料远离氧化石墨烯表面,染料的荧光恢复同时,生成的双链DNA 与核酸染料SYBR Green 结合,使荧光增强SYBR Green 是一种不对称的菁类嵌入性染料,它在水溶液中的荧光信号很弱,与单链DNA 几乎不发

4、生作用,但它与双链DNA 具有很强的亲和性,作用后其荧光强度会显著增加13Xiang 等14利用经典分子信标和SYBR Green 实现了对单链DNA 的双色定量检测由于经典分子信标在实际定量分析中存在两个问题一方面,经典分子信标较强的背景信号会严重影响检测的灵敏度;另一方面,当分子信标引入到复杂基质中时,由于非特异性吸附会使分子信标产生假阳性信号,影响定量检测的准确性为解决这些问题,本实验以氧化石墨烯(GO 为猝灭剂,并引入核酸嵌入染料SYBR Green I 对于荧光标记染料ROX 和核酸染料SYBR Green I 而言,它们的最大激发波长与最大发射波长的波长较接近,因此这两种染料的荧光

5、信号可以通过同步扫描荧光光谱法同时获得,可对目标DNA 实现双色荧光检测由于SYBR Green I 荧光信号的增强仅由SYBR Green I 与双链DNA 结合引起,而不受假阳性信号的影响,故利用SYBR Green I 的荧光信号对目标DNA 进行定量检测,能避免假阳性信号的产生,从而显著提高检测的准确度此外,利用双色荧光对核酸的定量检测,其灵敏度准确性和选择性均有所提高2实验部分2.1仪器与试剂所有的荧光光谱及荧光强度的数据均由RF 5301PC 型荧光光谱仪(日本Shimadzu 公司获得,同第41卷2013年3月分析化学(FENXI HUAXUE 特约来稿Chinese Journ

6、al of Analytical Chemistry 第3期325329623分析化学第41卷步扫描的荧光光谱中,激发波长与发射波长之间的波长间隔设置为20nm,激发和发射狭缝宽度均为10nmPB10酸度计(德国Sartorius公司;微量离心机(美国Thermo Scientific公司SYBR Green I(上海瑞安生物技术有限公司;TrisHCl缓冲溶液:由Tris,NaCl和0.1mol/L HCl配制;氧化石墨烯(GO,中科炭纳米科技公司;所有试剂均为分析纯;实验用水均为去离子水;所有的核酸均由工程(上海有限公司合成,其序列如下:荧光标记核酸探针(以下简称MB:5ROXTTT AA

7、A C TG A TT ACT A TT GCV A TCTY TCC GTTACA ACT TTT AAA3;目标DNA(以下简称T:5AGT TGT AAC GGA AGA TGC AA T AGT AA T CAG3;1个碱基错配DNA(以下简称MT1:5AGT TGT AAC GGA AGT TGC AA T AGT AA T CAG3; 2个碱基错配DNA(以下简称MT2:5AGT TGT AAC CGA AGA TGC AAA AGT AAT CAG3; 3个碱基错配DNA(以下简称MT3:5AGT TGT ATC GGA AGG TGC AAT ACT AAT CAG32.2样品

8、的制备杂交反应由荧光标记核酸探针与目标DNA在一定条件下完成先将适量目标DNA加入到适当浓度的荧光标记核酸探针溶液中并混合均匀,并在一定的温度下孵育一定的时间孵育的目的是为了破坏荧光标记核酸探针互补部分的双链,从而加速荧光标记核酸探针与目标DNA的反应速度将孵育后的溶液冷却至室温,待荧光标记核酸探针与目标DNA杂交完成后,加入核酸染料SYBR Green I工作液和氧化石墨烯(GO溶液在一个特定的反应中,将50m L目标DNA加入到50m L2.510-8mol/L荧光标记核酸探针溶液中,并混合均匀,在60水浴孵育10min冷却至室温,再将20m L SYBRGreen I工作液和10m L0

9、.15g/L氧化石墨烯加入至上述溶液中混匀,在室温下反应10min,补充缓冲溶液至500m L,最后对ROX和SYBR Green I的荧光信号进行同步荧光检测2.2.1染料溶液的配制SYBR Green I原始溶液为无水二甲基亚砜制备的10000倍浓缩液,工作液由缓冲溶液将浓缩液稀释10000倍而得2.2.2缓冲溶液的配制含有NaCl的Tris溶液,以0.1mol/L HCl调至所需pH值,得到相应的缓冲溶液2.2.3标准溶液的配制取盛有1OD(Optical density的T,MB,MT1,MT2及MT3离心管各一支,放入微量离心机中,以2000r/min离心2min后,加入适量超纯水,

10、涡旋混合1min,逐级稀释成浓度为1.0m mol/L的备用溶液2.2.4GO溶液的配制用超纯水将GO稀释为0.15g/L的备用溶液2.3目标DNA的检测目标DNA的检测通过测定MB和SYBR Green I的荧光信号实现MB所用染料ROX最大发射波长与最大激发波长的间隔为23nm,SYBR Green I最大发射波长与最大激发波长的间隔为20nm,本实验中同步扫描的波长间隔(姿设置为20nm2.4单碱基错配(SNP分析将50m L2.510-8mol/L目标DNA序列与相同数量的碱基错配序列按照上述样品制备过程进行准备,分别测定相应的荧光强度,最后进行比较和分析3结果与讨论3.1方法原理没有

11、目标DNA时,氧化石墨烯(GO对MB进行吸附,荧光染料ROX的荧光被氧化石墨烯猝灭;当有目标DNA存在时,目标DNA与MB杂交,形成双链DNA因双链DNA与氧化石墨烯的作用力减弱,使得荧光标记核酸探针的荧光基团染料远离氧化石墨烯表面,染料的荧光恢复;与此同时,嵌入染料SYBR Green I插入到双链DNA中,其荧光强度显著增加在这个分析体系中,荧光染料SYBRGreen I和ROX的斯托克斯位移很接近,因此通过同步扫描荧光光谱法即可实现双色荧光定量检测DNA,其原理如图1所示3.2分析方法的可行性在没有目标DNA 时,氧化石墨烯能把MB 的荧光猝灭,加入目标DNA 后,SYBR Green

12、和ROX 的荧光强度均得到不同程度增加,结果(图2表明,目标DNA 的浓度不同, 它们的荧光强度也具有显著图2分析原理光谱图Fig .2Fluorescence spectra of analysis principlea.2.510-9mol/L MB +20m L SYBR Green 工作液+3.010-3g/L GO;b.2.510-9mol/L MB +20m L SYBR Green 工作液+3.010-3g/L GO +1.210-9mol/L T (target DNA ;c.2.510-9mol/L MB +20m L SYBR Green 工作液+3.010-3g/L GO

13、 +2.010-9mol/L T 的区别,说明该方案是可行的 图1分析原理示意图Fig .1Schematic of analysis principle 3.3实验条件优化3.3.1嵌入性染料SYBR Green用量的影响SYBR Green 与T 作用的荧光强度非常弱,不能直接测定;T 与MB 杂交形成双链DNA 后,与SYBR Green 结合,荧光强度显著增强,因此必须考察MB T 及SYBR Green 加入量对荧光强度的影响,以提高检测的灵敏度和准确性在特定的反应中,SYBR Green 工作液加入量对体系荧光强度影响较大MB T 及SYBR Green 的浓度过大,相互影响较强,

14、体系稳定性较差;浓度太小,则荧光强度太低结果(图3表明,当加入20m L SYBR Green 工作液时,双峰的荧光强度稳定且比较接近故选择在500m L 溶液中加图3不同量SYBR Green 对MB 荧光强度的影响Fig .3Effect of different concentrations of SYBRGreen on fluorescence intensity 入20m L SYBR Green 3.3.2溶液pH 值的影响缓冲溶液的pH 值可显著影响荧光标记核酸探针与目标DNA 的杂交和荧光染料的荧光信号为了获得缓冲溶液最合适的pH 值,考察了不同pH 值的Tris HCl 缓

15、冲溶液对测定结果的影响结果表明,Tris HCl 缓冲溶液pH 值在7.09.0之间时,两种染料的荧光强度都随缓冲溶液pH 值的增加而增大且在pH =8.0时,两峰值完全相同因此,本实验中选择缓冲溶液pH =8.03.3.3盐浓度的影响盐的加入有利于单链DNA的舒展和互补DNA 的杂交,因此有必要在DNA 杂交溶液中加入适量盐;但若加入过多盐,将增加溶液中的离子强度而使体系荧光强度降低,影响检测的灵敏度,因此盐的优化也很重要本实验考察了不同盐(NaCl 浓度的Tris HCl 缓冲溶液对测定结果的影响结果表明,当NaCl 浓度为0.05mol/L 时,荧光强度最大故NaCl 最佳浓度为0.05

16、mol/L 3.3.4GO 用量的影响GO 对标记在单链核酸上的荧光染料及嵌入染料SYBR Green I 都具有猝灭作用考察了GO 用量对测定结果的影响结果表明,当GO 浓度为3.0mg/L 时,两种染料的荧光均基本被猝灭,故GO 浓度选择为3.0mg/L 3.4工作曲线和检出限在上述优化的实验条件下,对两种荧光染料的荧光强度与目标DNA 的浓度进行了考察(图4,结723第3期郑爱华等:基于荧光标记核酸探针及核酸染料SYBR Green 定量检测单链DNA 果表明,当T的浓度在110-10210-9mol/L,两种染料的荧光强度增加之(y和与T浓度(x具有良好的线性关系,其拟合的回归方程为y

17、=63.388x+9.3862,R2=0.9954,检出限为85pmol/L(3/斜率,为空白样品的标准偏差,n=113.5碱基错配DNA序列分析通过碱基错配DNA序列考察方法的特异性目标DNA和不同错配序列DNA在相同条件与荧光标记核酸探针和SYBR Green反应后,分别进行同步扫描,测定两种染料的荧光强度(D I为两峰荧光强度增强之和,图5结果表明,对于4种不同序列DNA(T,MT1,MT2和MT3,两种染料的荧光强度之和的比例分别为10041.4826.7518.50,说明本方法具有良好的选择性 图4不同浓度目标DNA同步扫描荧光光谱图Fig.4Fluorescence spectru

18、m with different concentrations of T 图5完全互补(T错配1(MT1错配2(MT2错配3(MT3的荧光强度差的变化图Fig.5Fluorescence intensity vs.different DNA sequences4结论本研究利用染料标记核酸探针(MB核酸染料SYBR Green I及氧化石墨烯(GO,建立了双色荧光定量检测特定单链DNA的新方法本方法具有较低的检出限(85pmol/L和较高的灵敏度;能将完全互补DNA序列与碱基错配序列区分开来References1Kang B,Yeo U,Yoo K H.Biosens.Bioelectron.,

19、2010,25(7:1592-15962RocheletDequaire M,Djellouli Limoges B,Brossier P.Analyst,2009,134(2:349-3533Bi S,Zhou H,Zhang S S.Chem.Commun.,2009:5567-55694LIU Gang,WAN Ying,ZOU ZiYing,REN ShuZhen,FAN ChunHai.Chinese J.Anal.Chem.,2011,39(7:953-962刘刚,万莹,邹子英,任淑贞,樊春海.分析化学,2011,39(7:953-9625Niu S Y,Zhao M,Hu L,Z

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24、2,HE ZhiKe *21(School of Public Administration ,Hubei University of Medicine ,Shiyan 444200,China 2(Key Laboratory of Analytical Chemistry for Biology and Medicine ,Ministry of Education ,College of Chemistry and Molecular Sciences ,Wuhan University ,Wuhan 430072,China Abstract A synchronous fluorescence spectral method was developed for the quantitative detection of sequencespecific DNA.Graphene oxide was used to quench the fluorescence of the dyes.When the target DNA was added,the fluorescences of the two dyes wer