丙型肝炎病毒与荧光素酶融合基因细胞模型的初步建立

1、    丙型肝炎病毒与荧光素酶融合基因细胞 模型的初步建立        摘要：目的建立容易检测的丙型肝炎病毒(HCV)细胞模型。 方法利用基因重组技术，构建HCV cDNA与荧光素酶(luc)融合基因可调控逆转录病毒载体；通过脂质体介导方法转染人肝癌细胞(HHCC)，观察luc基因的表达。 结果成功地将luc基因融合于HCV C区和大部分E1区基因的下游，构建了带HCV-luc融合基因的真核表达载体(pBPST-HCV-luc)；该载体在细胞内有效表达luc活性，

2、puromycin筛选可提高luc的表达水平，并可受四环素的调节。 结论初步建立了表达HCV C-E1和luc融合基因的可调控转染细胞模型，为以HCV C-E1为靶的基因治疗提供研究工具。关键词：丙型肝炎病毒； 细胞模型； 荧光素酶； 逆转录病毒载体Establishment of a controllable cell model with fusion gene of hepatitis C virus cDNA and luciferase reporter geneJIA ZhanshengZHOU YongxingJIAO Chengsong, et al（Department of

3、 Infectious-Diseases, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038,P.R.China）Abstract：ObjectiveTo establish HCV cell culture model which is easy to measure. MethodsControllable retroviral vector with fusion gene of hepatitis C virus (HCV) cDNA and luciferase (luc) reporter g

4、ene was constructed by molecular cloning technique, the transfection of this retroviral vector in a human hepatic carcinoma cell (HHCC) line was performed by lipofectAMINE and then luciferase activity in the cellular lysate was measured by scintillation counter. Results Fusion gene of the HCV 5 NCR-

5、C region and luciferase reporter gene identified by restriction endonuclease cleavage have been cloned into pBPSTR1 vector. The luciferase activity could maintain up to 20 days at least, and could be increased by puromycin treatment and regulated by tetracycline. ConclusionA cell model for expressio

6、n of HCV C-E1 and luciferase genes was established for gene therapy studies against HCV C-E1 sequences. Key words：Hepatitis C virus； Cell model； Luciferase； Retroviral vector近年来，国内外学者从选择HCV敏感的细胞系开始，用不同接种材料，成功地获得了用于不同研究目的的HCV体外细胞培养模型1-2。然而，HCV在细胞内的复制和表达不稳定，检测方法不敏感，作为抗病毒药物筛选模型尚不令人满意。本研究应用可调控逆转录病毒载体pBP

7、STR1，重组了HCV cDNA与luc融合基因逆转录病毒载体，以期建立能在体外持久表达HCV-luc融合基因的转染细胞，为抗病毒治疗提供检测方便敏感的细胞模型。材料与方法主要试剂：工具酶，marker,琼脂糖等购自华美公司或Promega公司。质粒和宿主菌：pGEM-luc-DNA质粒为Promega产品，由北京医科大学李勇年博士惠赠3。pBPSTR1由美国Harvard医学院Reeves教授惠赠4，为四环素调控性逆转录病毒载体。pBRTM/HCV1-3011(HCV-H)质粒，由美国华盛顿大学Rice教授惠赠5。pGEM3zf(+)等由本校生化教研室惠宏襄博士惠赠。JM109菌本室保存。载

8、体的构建：从pBRTM/1-3011质粒用Hind+BamH切下1374bp的片段，内含HCV基因序列的第3361358bp和该质粒的357bp，反向插入pGEM-luc-DNA的Hind和BamH位点，HCV的C和E1融合于luc基因的上游，命名为pGEM-HCV-luc，然后再从该载体上分别用Sal+Hind双酶切下3057bp的片段，平端克隆于pBPSTR1的Not(补平)位点，酶切鉴定方向正确者，即HCV-luc融合基因正向插入于载体的CMV启动子的下游，该重组质粒命名为pBPST-HCV-luc。细胞培养与DNA转染：将人肝癌细胞系(human hepatic carcinoma c

9、ell,HHCC)细胞培养至50%覆盖时，用LipofectAMINE介导的质粒转染方法，转染经PEG纯化的质粒DNA 10g/60mm平皿，具体方法按试剂盒说明书操作。克隆筛选：细胞转染后48h，胰酶消化，1?5传代，pBPST-HCV-luc用puromycin 2g/ml(Sigma)筛选，每3d换液1次，不同时间收集细胞，留作克隆筛选者继续培养至克隆长出。细胞的收集与提取液的制备：按试剂盒说明操作。弃去培养液，用预冷的灭菌PBS洗细胞2次，每培养瓶(25ml)加入200l预先稀释好的细胞裂解液，置室温15min，晃动培养瓶，观察细胞裂解情况。待细胞完全裂解时，用橡皮擦刮取细胞，瞬时振荡

10、，将细胞和裂解液转移至1.5ml Eppendorf管，离心，收集上清，-70保存。荧光素酶(luc)的活性检测：取20l细胞裂解液，加入1.5ml Eppendorf管，加100l luc测试液，混匀；尽快用液体闪烁计数仪计1min的cpm值。结果1.重组载体的酶切鉴定：pGEM-HCV-luc用BamH可线性化，用Xho可切下理论为2075bp大小的片段，用Hind+Sal双酶可切下理论为3057bp大小的片段。pBRST-HCV-luc用Hind筛选可线性化，相对分子质量比载体大3057bp者为阳性克隆，用Hind和BamH酶切鉴定(1)。1pBPST-HCV-luc载体的酶切结果(1%

11、琼脂糖)Fig 1. Maping of pBPST-HCV-luc vector by BanH and Hind1.DNA/EcoR+Hind marker;2.BamH;3.Hind;4.DNA/Hind marker 2.重组载体在转染细胞中的表达：在转染HHCC细胞后第3、5、10、15和20d收集细胞裂解液，检测其luc活性。结果表明:pBRST-HCV-luc可在HHCC细胞内有效表达luc活性，并随转染后的时间变化及抗性筛选而不同。经puromycin筛选，luc活性逐渐升高，至15d以后基本稳定(2)。2pc-HCV-luc和pBPST-HCV-luc转染细胞luc活性的比较

12、Fig 2. Luciferase activity in HHCC transfeced 3.四环素对pBPST-HCV-luc载体luc活性表达的影响：应用pBPST-HCV-luc转染的HHCC细胞，经puromycin筛选后第15d，其多克隆细胞产生luc活性较为稳定，接种于6孔培养板中，用含1.5g/ml四环素(Sigma)的PRMI 1640培养，第2、3和5d收集细胞，检测luc的活性。结果表明，加四环素后第2d luc表达就明显下降，第3d后基本稳定，与对照组(未加四环素组)相比明显下降(P<0.01，见3)。为观察四环素与luc活性之间的关系，我们应用不同浓度(0.5、

13、1.0、1.5、2.0、2.5g/ml)的四环素，在第3d收集细胞，检测luc活性表明，两者存在明显的量-效关系。3四环素对pBPST-HCV-luc转染细胞luc的调节Fig 3. Regulation of luciferase activity by tetracycline 讨论HCV基因表达的稳定性和检测方法的敏感性是建立HCV体外细胞模型的关键，也是抗病毒基因治疗研究的基础。国内外学者近年来为此作了不少努力。刘勇等2应用H9细胞(人CD4+T细胞)，建立了重组的HCV基因转染细胞模型，经RT-PCR，dot ELISA和Western blot等方法证明，该细胞模型至少可持续3个月

14、。然而，该模型的检测不易定量。荧光素酶基因(luc)作为报告基因的一种，已广泛用于基因调控的研究。Alt等6将luc基因融合在HCV C区66bp的下游，使其受HCV 5NCR的调控，用检测luc活性的方法，方便地研究了抗HCV 5NCR的反义寡核苷酸的抑制作用。逆转录病毒载体可将其基因组整合于细胞染色体中，使外源基因得以持久表达。本研究选择四环素调控性逆转录病毒载体，将HCV C-E1区与luc融合基因插入该载体，经转染细胞用抗性筛选证明，HCV-luc基因在HHCC细胞内表达可持续20d之久，同时应用抗HCV C蛋白单克隆抗体做Western blot证明，HCV C区基因也有效表达。然而

15、，要建立稳定表达，发生基因整合的细胞克隆还需要进一步筛选，长时间观察luc基因的表达活性。实现有效的基因治疗目的，要求载体能够在真核细胞内高效表达目标基因，并可调节目标基因在细胞内的表达。Paulus等4构建的pBPSTR1是一受四环素调控的逆转录病毒载体，内含有四环素控制的转活化子和四环素反应启动子，可作为研究基因调节和基因治疗的真核载体。本文结果，pBPST-HCV-luc的表达可受四环素调节，提示该载体还可用于其它基因功能的研究，或作为基因治疗载体，以便在细胞内有选择性地控制目标基因的表达。作者单位：贾战生（第四军医大学唐都医院传染科）周永兴（第四军医大学唐都医院传染科）焦成松（第四军医

16、大学唐都医院传染科）冯志华（第四军医大学唐都医院传染科）连建奇（第四军医大学唐都医院传染科）李谨革（第四军医大学唐都医院传染科）李光玉（第四军医大学唐都医院传染科）参考文献：1Kato N,Nakazawa T,Mizutani T,et al.Susceptibility of human T lymphotropic virus type I-infected cell line MT-2 to hepatitis C virus infection.Biochem Biophys Res Commun,1995,206:863-869.2刘勇，陈智，刘克洲，等.重组丙型肝炎病毒基因转染H9细胞模型的建立.中华肝脏杂志，1997，5:103-105.3李勇年，王勤环，斯崇文，等.丙型肝炎病毒基因调控细胞模型的建立及其意义.中华医学杂志，1997，77:609-611.4Paulus W,Baur I,Reeves SA,et al.Self-contained,tetracycline-regulated retroviral vector system for gene delivery to mammalian cells.J Virol,1996,70:62-67.5Grakoui A,Wychowski C,Rice CM,et al.Expression