以L_半胱氨酸和吲哚酶法合成L_色氨酸

1、药物生物技术Pharmaceutical Biotechnology2000,7(4:197199文章编号:100528915(20000420197203以L2半胱氨酸和吲哚酶法合成L2色氨酸韦平和吴梧桐(中国药科大学生物制药学院,南京210009摘要用色氨酸酶基因工程菌WW24催化L2半胱氨酸和吲哚合成L2色氨酸。80ml反应液(L2半胱氨酸0175g,吲哚0.75g37反应48h,可积累L2色氨酸1.18g。L2半胱氨酸转化率为93.2%,吲哚转化率为90.1%。产品总回收率达70%,所得晶体在熔点、旋光性和红外吸收光谱等方面与标准品完全一致。关键词L2半胱氨酸;L2色氨酸;色氨酸酶基因

2、工程菌;转化中图分类号:TQ46417文献标识码:A色氨酸酶正常情况下降解L2色氨酸生成丙酮酸、吲哚和氨,但在高浓度的丙酮酸和氨条件下也能有效地催化丙酮酸、吲哚和氨合成L2色氨酸2。该酶还能催化L2丝氨酸或L2半胱氨酸和吲哚合成L2色氨酸3。Nakazawa等(19724以20g吲哚、30g丙酮酸钠、50g乙酸铵和4g Proteus rettgeri菌体作为色氨酸酶源,37反应48h,可积累23g L2色氨酸。Ujimaru等(19835用A chro2 mobacter liqui dum色氨酸酶催化L2丝氨酸和吲哚合成L2色氨酸,L2丝氨酸转化率为8214%,吲哚转化率为9214%。鉴于

3、国内外尚未报道以L2半胱氨酸和吲哚为原料酶法生产L2色氨酸,故本文用自行构建的色氨酸酶基因工程菌WW246,以L2半胱氨酸和吲哚为底物合成L2色氨酸,试图为工业化生产L2色氨酸建立一条合理、可行的工艺路线。1材料111菌株和培养基色氨酸酶基因工程菌WW24由本室构建,E. coli BL21由南京大学生化系徐贤秀教授惠赠,LB 培养基(1%胰化蛋白胨,015%酵母抽提物和1%氯化钠。112试剂磷酸吡哆醛(PL P、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG、还原型谷胱甘肽和对二甲氨基苯甲醛分别购自Sigma公司、Promega公司、中国新兴医药保健品开发公司和上海试剂三厂;L2半胱氨酸、L2色氨酸购自上海伯

4、奥生物科技公司;吲哚购自上海双喜香料助剂厂,其它试剂均为国产分析纯。113仪器J22HS高速冷冻离心机(Beckman公司, DDHZ2300多用途台式恒温振荡器(江苏太仓实验设备厂,ZFQ85A旋转蒸发器(上海医械专机厂, 835氨基酸自动分析仪(Hitachi,DSC225差示扫描量热仪(Mettler公司,241MC旋光仪(PE公司,IMPACT410红外光谱仪(Nicolet公司。2方法211工程菌WW24色氨酸酶的诱导表达取一个WW24单菌落接种于LB培养基,37培养过夜以获得饱和培养物,将饱和培养物以1%接种于含791收稿日期:1999-10-10Am p (100g/m l 的L

5、B 培养基中,37继续培养2h 后,添加IPTG 至终浓度1mm ol/L ,诱导表达色氨酸酶7。212色氨酸酶的活力测定按文献8进行。酶的一个活力单位定义为:在一定反应条件下,37、10min 催化形成0101mol 吲哚所需要的酶量。213L 2色氨酸的酶法合成条件在80ml 0.1mol/L 磷酸钾缓冲液中,分别添加0.75g L 2半胱氨酸、0.75g 吲哚、0.5mmol/L PL P 以及由150ml 培养液离心后收集的细菌沉淀,调p H 8.8后置37摇床轻缓振荡使反应进行12,24,36和48h 。214反应液中L 2色氨酸的检测将振摇一定时间的反应液经适当稀释后于12000r

6、/min 离心2min ,取上清液10l 进行纸层析检测,展开剂系统正丙醇氨水水(20153。对不同转化时间反应液中的L 2色氨酸以氨基酸自动分析仪进行定量分析。3结果3.1WW 24色氨酸酶最佳活力的选择经IPTG 诱导0.5,1,2,3和4h 的色氨酸酶基因工程菌WW 24,其活力测定结果见图1。由图1可知:诱导1h 左右的色氨酸酶活力最高,故选择诱导1h 的细胞作为L 2色氨酸酶法合成的酶源 。Fig 1E ffect of induction time on the activity of WW 24tryp 2tophanase312L 2色氨酸的酶法合成由0.75g L 2半胱氨酸

7、、0.75g 吲哚、0.5mm ol/L PLP 、0.1m ol/L 磷酸钾缓冲液及150ml 培养液离心后收集的细菌沉淀组成80ml 的反应体系,调pH 8.8后于37反应48h ,通过纸层析分析(图2和氨基酸自动分析仪定量,可积累1118g L 2色氨酸。L 2半胱氨酸转化率为93.2%,吲哚转化率为90.1%。L 2色氨酸随转化时间的浓度变化见Fig 3 。1:Authentic L 2cysteine (5mg/ml ;2:Reaction catalyzed by trypto 2phanase from host strain (reaction 48h ;3、4、5:React

8、ions catalyzed by tryptophanase from engineered strain WW 24(reaction 24、36and 48h ,respectively ;6:Authentic L 2tryptophan (5mg/ml Fig 2Paper chromatogram of L 2 tryptophanFig 3Synthesis of L 2tryptophan by tryptophanase313L 2色氨酸的分离纯化将收获的转化液于5000r/min 离心15min ,以分离残留的吲哚和菌体。弃沉淀,上清用1%活性炭于80脱色处理20min ,

9、抽滤,滤液用HCl 调p H 至510,并于4静置12h 。离心后所得上清用#732阳离子交换树脂分离,5%氨水洗脱,洗脱液的纸层析图谱显示L 2色氨酸和L 2半胱氨酸混合物可逐渐分离为单一的L 2色氨酸。将纸层析显示只含L 2色氨酸斑点的洗脱液合并,55减压浓缩近乎糊状,过滤后所得粗品于水中重结晶两次,可得白色、片状的L 2色氨酸晶体。产品L 2色氨酸的总回收率为70%。891药物生物技术第7卷第4期314L 2色氨酸产品的质量分析31411熔点差示扫描量热仪测定结果为27418,与标准品27613相差115。31412旋光度PE 2241MC 测定结果为28D -31.34,符合中国药典(

10、1990版附录-30-33要求。色氨酸酶催化丙酮酸、吲哚和氨合成L 2色氨酸的酶法途径中,由于底物吲哚对色氨酸酶抑制作用较弱,且丙酮酸价格不高,因而具有一定的实用性,但该途径是色氨酸水解的逆反应,要求底物浓度较高,反应平衡不易把握。以L 2丝氨酸和吲哚为原料合成L 2色氨酸的酶法途径,所用的L 2丝氨酸价格几乎与L 2色氨酸相当,因此实用性不强。本文用色氨酸酶基因工程菌催化L 2半胱氨酸和吲哚合成L 2色氨酸,所用底物L 2半胱氨酸可通过毛发水解提取L 2胱氨酸后电解还原制得,产量高,价格低廉,且L 2半胱氨酸转化率为93.2%,吲哚转化率为90.1%,产品总回收率达70%。所以该酶法途径具有

11、重要的工业化应用价值。以L 2半胱氨酸和吲哚合成L 2色氨酸的酶法途径主要存在两方面的困难,一是L 2半胱氨酸在反应过程中易氧化成L 2胱氨酸;另一是在分离纯化过程中吲哚、L 2半胱氨酸和L 2色氨酸不易分离。前者可通过抗氧化剂、间歇添加L 2半胱氨酸等方法予以部分解决。至于后者,杨文革等(19969报道用#330和#732两种树脂串联起来能有效地去除残留吲哚,并且对色氨酸的总回收率大于70%。但L 2半胱氨酸和L 2色氨酸的有效分离尚有待进一步的完善。参考文献1韦平和,吴梧桐1色氨酸生物工程研究进展J 1药物生物技术,1998,5(3:1802Watanabe T ,Snell E.Reve

12、rsibility of the tryptophanase reaction :synthesis of tryptophan from indole ,pyruvate and ammonia J .Proc N atl Acad Sci US A ,1972,69(5:10863Newton W A ,Morina Y ,Snell E.Properties of crystalline trypto 2phanase J .J Biol Chem ,1965,240(3:12114Nakazawa H ,Enei H ,Okumura S ,et al .Synthesis of L

13、2trypto 2phan from pyruvate ,ammonia and indole J .A gr Biol Chem ,1972,36(13:25235Ujimaru T ,Kakimoto T ,Chibata I.L 2Tryptophan production byAchromobacter liqui dum J .A ppl Envi ron Microbiol ,1983,46(1:16韦平和,吴梧桐,张玉彬1大肠杆菌色氨酸酶基因的克隆和表达J1中国药科大学学报,1999,30(2:1397Sambrook J ,Fritsch E F ,Maniatis T.Mol

14、ecular cloning M .2nded New Y ork Cold Spring Harbor Laboratory press ,19898韦平和,吴梧桐,余方兵1色氨酸酶基因工程菌的活力及其与表达关系研究J 1药物生物技术,1999,6(2:709杨文革,胡永红,欧阳平凯,等1酶法合成中色氨酸的分离J 1工业微生物,1996,26(1:27E nzym atic Synthesis of L 2T ryptophan from L 2Cysteine and IndoleWei Pinghe ,Wu Wutong(School of B iopharm aceutics ,Chi

15、 na Pharm aceutical U niversity ,N anji ng 210009Abstract L 2Tryptophan was enzymatically synthesized by tryptophanase in genetic engineered strain WW 24from L 2cysteine and indole. 1.18g of L 2tryptophan was formed from 0.75g of L 2cysteine and 0.75g of in 2dole in 80ml reaction mixture shaking for 48h at 37.The conversion rate was 93.2%for L 2cysteine and 90.1%for indole.The total separation recovery of the products was 70%,and the pr