人线粒体DNA荧光定量PCR检测方法的建立

1、人线粒体DNA荧光定量PCR检测方法的建立        【摘要】  建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人线粒体DNA的方法。选取人线粒体DNA高度保守基因片段，将该基因片段与pCF-T载体连接后，转化入E.coli DH5，提取重组质粒PCR及测序鉴定后，作为阳性模板建立SYBR-Green I荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线。结果表明：构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含101108拷贝时,扩增反应CT值与拷贝数的对数成线性关系)，相关系数为0.997。批内和批间重复性测定的变异系

2、数分别为1.23%3.29%以及3.10%5.21%。我们成功建立了实时荧光定量PCR检测人线粒体DNA的方法，该方法可作为进一步研究线粒体DNA的方法，在相关疾病诊断和监测中具有一定的应用前景。 【关键词】  SYBR Green I；荧光定量PCR；线粒体DNA；聚合酶链反应；人    Key words：SYBR Green I; Fluorescent qunantitative PCR; Mitochondrial DNA；Polymerase chain reaction；Human    1  引&#

3、160; 言    线粒体作为真核细胞中一种重要而独特的细胞器，其性状和数量的改变与人的疾病密切相关。研究线粒体与疾病的关系，既有理论意义，在医学上也有潜在的应用前景。称为细胞动力工厂的线粒体，因其生命周期有限，具有高的更新率，形态、大小、数量和分布常因细胞种类不同而异。本研究旨在建立人线粒体DNA荧光定量PCR方法，为进一步研究线粒体DNA与人的疾病的关系奠定基础。    1  材料与方法    1.1  实验材料    人EDTA抗凝血2 ml，菌种为

4、本室保存的大肠杆菌E.coli DH5。    1.2  试剂    pCF-T 连接试剂盒、PCR 反应试剂盒、DNA 产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自TIANGEN公司；BigDye Terminator v3.1 试剂盒、SYBR PCR Mastermix  购自ABI公司；人淋巴细胞分离液购自灏洋生物公司。    1.3  仪器    BIO-RAD公司iCycler荧光定量PCR仪，HERAEUS公

5、司高速离心机BIOFUGEPICO，ABI公司 9700 PCR扩增仪，大和公司恒温金属浴，BECKMAN公司紫外分光光度计DU-640，复星公司电泳仪，KODAK公司凝胶成像系统，ABI公司310测序仪。 1.4  目的片段引物的设计、合成    比较人线粒体DNA全序列，设计特异引物，引物由三博远志合成，序列如下:    上游引物：    5-ATACCCATGACCAACCTCCTACTCCTCATT-3；    下游引物：   

6、 5-CTGCTCGCAGTGCGCCGATCAGGGCGTAGT-3。    1.5  DNA样品的提取、扩增及回收    取人EDTA抗凝血2 ml，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，分别吸取人单个核细胞（1×106/mL）5 ul，离心，弃上清。放入20 ul裂解液中(Chelex reagent), 56 消化1 h，98 10 min, DNA样品-20保存。PCR 反应体系：上下游引物各1 ul （10  umol/L）、dNTPS 2 ul、Taq DNA聚合酶0.5 ul、10

7、5;Taq Buffer 2.5 ul、DNA样品2 ul、ddH2O 16 ul,轻轻混匀，短暂离心，按照下列条件进行扩增:94预变性5 min；95 30 s、55 45 s、72 45 s,共35个循环；72延伸3 min。PCR产物于琼脂糖凝胶上进行电泳、检测，并用胶回收试剂盒纯化回收。    1.6  克隆载体的构建    回收的片段与pCFT载体连接，产物转化DH5菌，然后利用Amp抗性进行筛选。从平板中挑出7株转化菌，按质粒抽提试剂盒提供的方案配液、提取。对质粒进行PCR电泳鉴定，鉴定阳性的质粒用测序证实。1

8、            1.7  荧光定量PCR标准曲线制作    用紫外分光光度计检测质粒浓度人线粒体，进一步转换成拷贝浓度，用水10倍梯度稀释成108-101拷贝/u1。使用SYBR PCR Mastermix kit（ABI）,BIO-RAD iCycler PCR仪测定扩增曲线和标准曲线,总反应体系为25 L。内含:上下游引物(10 mol/L)各1 L, SYBR PCR Mastermix  12.5 L，模板1 L，PCR

9、级水8.5 L。反应条件为: 95 5 min；95 30 s，55 45 s，72 45 s，每循环延伸后检测荧光，共38个循环，72 7 min。    1.8  熔解曲线的制作    95 2 s后以0.3/3 s降温到65，连续检测荧光信号，绘制PCR产物的熔解曲线,以了解样品扩增的特异性,保障测定结果的准确可靠。    2  结果    2.1  重组质粒的鉴定和DNA序列分析    将构建重组质粒用设计的

10、引物进行扩增，2%琼脂糖凝胶电泳检测，发现特异的目的条带（405bp），见图1。鉴定阳性的质粒进行测序，结果见图2，测序结果与预期序列进行比对，结果序列完全相同，说明目的片段已经成功重组。    2.2  标准曲线和线性关系    反应体系中含1×1011×108拷贝分子时，扩增反应CT值与拷贝数的对数呈线性关系，标准曲线回归方程为 Y=-3.320X+38.983，其中Y为CT值，X为质粒模板拷贝数以10为底的对数，见图3。 标准曲线显示出相关系数为0.997。    2.

11、3  标准曲线的灵敏性    将线粒体DNA标准品做梯度稀释(1×1011×108)，进行荧光定量PCR，得到系列曲线，至每个梯度均有特征性扩增曲线，呈明显的“S”型，见图4。说明用此引物通过荧光定量PCR测定人线粒体DNA敏感性好。    2.4  特异性    用抽提的线粒体DNA作为阳性模板，结果与预期完全相符,无非特异性扩增。而非靶模板的反应孔无荧光信号出现。熔解曲线只见一特异性峰, 见图5，说明此引物特异性高，表明该方法有良好的特异性。 

12、0;  2.5  重复性实验    将系列稀释的质粒标准品,用荧光定量PCR重复测定3次,每次每个稀释度重复3管。结果表明,用该方法检测的批内和批间变异系数分别为1.23%3.29%以及3.10%5.21%,说明该方法具有较好的可重复性及再现性。    3  讨论    线粒体是真核细胞内的重要细胞器，不仅维持细胞正常生理功能，在细胞凋亡和死亡中也发挥重要作用。线粒体是细胞能量生成场所，通过氧化磷酸化为有机体，提供90%的ATP能源；参与尿素循环，调节细胞内Ca2+平衡，从而

13、参与细胞信号转导。线粒体参与细胞凋亡功能的发现加深了对细胞凋亡机制的理解。它还产生还原性物质有利于细胞的解毒功能。可见，线粒体在生物的生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面都有非常重要的意义。    近年来国内外对mtDNA与肿瘤之间的关系有所研究，并提出了一些假说，已有的研究资料提示肿瘤的生物学特征不仅取决于核内遗传物质，而且与核外的线粒体DNA也有一定的关系1，可能与易受损伤而不易修复有关。线粒体DNA基因组缺乏损伤修复系统而又直接暴露于氧化磷酸化过程所产生的高氧环境，是其发生损伤的重要因素。加之线粒体基因组结构特点：(1)线粒体内脂肪/DNA的

14、比值很高，使具有嗜脂性的致癌物优先在占细胞总DNA量很少的线粒体DNA聚集2；(2)线粒体DNA缺乏组蛋白的保护，即是裸露的。因此线粒体DNA是致癌物作用的重要靶点，其损伤程度和突变率显著高于核DNA（大约10倍于核）3。由于线粒体DNA修复机制发育不良，效率低下，线粒体DNA的突变导致线粒体功能缺陷，线粒体DNA只有过度复制产生惊人的拷贝数才能补偿此缺陷4。因此需要建立一个定量检测线粒体DNA的方法。    实时荧光定量PCR技术是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。SYBR

15、 Green 是双链DNA荧光染料,通过特异性地掺入DNA双链后发出荧光，因此，PCR 反应中SYBR Green的荧光强度与PCR产物的增加一致5-7 。与传统的PCR方法相比，SYBR Green荧光定量PCR扩增具有高效性和高敏感性，可进行定量分析，且通过产物熔解分析可确定产物的特异性。反应全程为闭管操作，检测结果由机完成分析，提高了工作效率，防止了扩增产物的污染。与Taqman探针法相比，操作简单且成本低。    本实验中，我们通过构建人线粒体DNA的质粒作为阳性标准品，采用SYBR Green荧光定量PCR方法，建立了线粒体DNA的定量检测方法。结果显示

16、，反应体系具有较高的检测敏感性，能检测到低载量（10 拷贝）的模板；模板浓度在101108拷贝反应时，反应体系具有良好的重复性和特异性。与传统PCR相比，扩增效率高，并降低了产物可能引起的潜在污染。因此该方法的成功建立，在线粒体相关疾病的诊断、的监测中有一定的应用前景。【】  1冯作化.医学分子生物学M.北京:人民卫生出版社,2005：149.2Shay JW, Werbin H. New evidence for the insertion of mitochondrial DNA into the human genome: significance for cancer and agingJ. Mutat Res,1992, 275(36):227-235. 3高泽.线粒体DNAM.北京:出版社,1982：1-4.4Bianchi NO, Bianchi MS, Richard SM. Mitochondrial genome instability in human cancersJ. Mutat Res,2001,488(1):9-23.5Simpson DA, Feeney S, Boyle C,et al. Retinal VEGF mRNA measured by SYBR green I fluorescenc