结构生物学(电镜,核磁共振,X射线衍射,质谱)

1、²第一，凡要发挥功能和活性的生物大分子必须具有特定的，自身特有，相对稳定的三级结构;²第二，结构运动。任何的破坏促使没有稳定的三级结构和结构运动，生物大分子是很难发挥生物功能或活性的。结构生物学是通过确定生物大分子三级结构，来研 究生物大分子的结构功能关系，从而探讨生物大 分子的作用机制和原理作为研究目的。 主要研究方法: ² X-射线晶体衍射方法（X-射线蛋白质晶体学） ² 多维核磁共振（ NMR ） ² 电镜晶体学和电镜三维重组方法 系，如二维的晶体和对称性很高的三维²年代，多维核磁共振波谱学的发明使得在水溶研究生物大分子成为可能

2、,水溶液中的生物大分更接近于生理状态.²年代到本世纪初，冷冻电子显微镜的发明，这种明使我们不仅能够研究生物大分子在晶体状和溶液状态的结构，而且能够研究研究复杂的大分系超分子体系，这就是细胞器和细胞.见结构生物学的发展过程经历了从结晶到溶液再到系，超分子体系，如核糖体(ribosome)、病体(lysosome)和线粒体等. ²年底,应用X 射晶衍射方法完成了核小体心颗粒分辨率为的精细空间结构定,每个核小体的盘心含有8个组蛋白形八面体、外绕146 基对组成的DNA ,这出的成就对了解基、DNA复制与修复态过程都很重要.,应用X 射线单晶衍射技术测定蛋白质和核酸并结合分子模拟技

3、术,已经为新药物的供了一个全新的方向,大大缩短了新药的研制过程. 的设计和开发,要求对这些药物靶标( drug 的结构、性能有精确的了解,由于迄今对了解甚少,现有临床药物绝大多数是通过尝试筛选,导致研制一个新药常常需十多年,甚至几十间.过对爱滋病病毒(HIV) 蛋白酶精细结构测定,并以此为靶标酶的抑制剂作为治疗爱滋病效药物获得巨大成功,已显少爱滋病死亡数量.Questions?为什么要用X-射线?为什么要用衍射?什么是晶体，为什么要用蛋白质晶体进行衍射?如何根据衍射结果解析蛋白质结构?X-rayProteinCrystalX射线是波长在 100Å0.01Å之间的一种电磁辐射

4、 , 常用X射线波长约在2. 5Å0.5Å之间，与原子以及化学键的尺度相当，都在 Å的数量级。因此 可以被用来探测蛋白质分子内部的结构。 把透镜换成X射线透镜把光源换成X射线到目前为止人类还没有发现什么方法能够让X-射线发生折射。所以当前只能通过衍射这种不那么直观的方法来研究蛋白质分子内部构造。什么是晶体？NaNaNaNaNaNaNaNaNaNaNaNaNaNaNaNaNa² 基本方程 ³ 劳厄定律 ³ 布拉格定律 一束X-射线f(x) = A cos(2x )来说，无论它的初始相角是多少，它在接收所形成的曝光点都是相同的。反之，我们

5、只根据接收屏上的曝光点也是无法得的X-射线的初始相角信息的。相角无法直接测量得到，但它又是求解电子密度时所必需的信息。这就是X-射晶体衍射法解析物质结构时所需要解决的核心问题相位（相角）问题。解决相位问题的方法：1.同晶置换法（MIR）：最原始的方法，包括多对同晶置换法和单对同晶置换法。需要在蛋白质晶体中引入重原子，并且要求引入了重原子的晶体与未引入重原子的晶体的晶型基本相同。解析过程需要未引入重原子、引入了重原子，甚至引入了不同重原子的多颗晶体的多套衍射数据。2.反常散射法（AD）：包括多波长反常散射法（MAD）和单波长反常散射法（SAD）。通常需要引入具有较强反常散射能力的原子，如硒原子。

6、不需要多颗晶体但往往需要同一颗晶体在不同波长X-射线照射下的多套衍射数据。随着技术的进步，目前蛋白质自身的硫原子也开始被用来作为反常散射源。3.分子置换法（MR）：需要同源性较高的蛋白质分子结构模型，不需要多颗晶体，不需要多套衍射数据，方便快捷，但不能用来解析全新的结构。4.直接法（Direct method）。这是未来的方法，对蛋白质来说仍处在向实际应用的发展阶段。主要技术流程图v蛋白质分子必须均一（纯化）均一的蛋白质分子不均一（不纯）的蛋白质分子沉淀沉淀剂浓度未饱和成核区过饱和区蛋白质浓度蛋白质分子体积大，分子表面情况复杂，性不明显，分子间作用力弱等原因，蛋白质在达到过饱和的时候不容易有序

7、排列形成容易随机聚合形成沉淀。因此需要对不同蛋白质筛选各自的结晶条件。晶技术：v整批结晶法v液液扩散法v透析法v气相扩散法a. 悬滴法b. 座滴法1µl 蛋白溶液1µl 结晶溶液结晶溶液成分：v沉淀剂通常为不同分子量的聚乙二醇或者高浓度的硫酸铵、氯化钠等。v辅助分子通常为低浓度的盐vpH缓冲剂例如：HamptonResearchCrystalScreenKit#140.2MCaCl20.1MHEPESpH7.528%(v/v)PEG400Detergentsandadditives最初筛选得到的结晶条件往往不是该蛋白的最佳结晶条件。此时的蛋白质晶体往往衍射能力很差，甚至没有

8、衍射。因此一般来说还需要对该蛋白质的结晶条件进行优化。优化前优化的方法就是把结晶溶液中的沉淀剂、辅助分子，结晶时的蛋白质浓度在原浓度附近做一个梯度；相应地，结晶溶液中的pH值也要在原值附近做一个梯度。在把这些梯度排列组合起来，从而找出一个最佳的结晶条件。优化后² ² ² ² ² X射线衍射数据的收集质量对于结构的解析至关重要。 一套高质量的数据往往会使随后的结构解析工作达到事半功 倍的效果。 由于蛋白质晶体内部含有大量的溶剂，热损伤和辐射损伤的 影响，室温时蛋白质分子非常容易失去其三维结构。而且辐 射损伤使数据收集受到干扰，使得测量产生实验误差

9、。 早些时候，收集一套完整的数据需要几颗甚至十几颗晶体才 能完成，这需要数据套之间的良好整合，为结构解析带来了 非常不利的影响。 快速冷却至低温（flash-cooling）收据数据的方法解决了这 个问题，同时这一技术也使捕捉存在时间很短的中间态成为 可能。 具体操作：1、使用晶体前，需要测试防冻液以确定玻璃化状态的最小的浓度。先用一个mounting assembly（loop的尺寸要与晶体大小匹配），在母液中蘸一下后迅速放在有低温氮气流的X-射线衍射仪的测角头上，在显微镜或屏幕上进行观察，如果液滴变为不透明（乳白色），则说明单纯的母液不能在低温冷却时使用，需要使用防冻剂。2、选择不同的防冻

10、液和浓度直到被冷冻的溶液仍然澄清，则这个浓度的防冻液就是你所需要的低温冷却条件。随后便可以用晶体进行测试了。选择一颗合适的晶体，在所确定的防冻液中蘸一下迅速放在有低温氮气流的X-射线衍射仪的测角头上，测试其衍射情况。由于晶体会与单纯的母液对低温冷却的反应不同，因此还需要进行一系列的测试，以找到合适的条件，以使晶体在低温氮气中仍为透明的颜色。3、还可采用系列浸泡，透析和交联等等方法得到衍射较好，且镶嵌度小的晶体用于数据的收集。² 同步辐射的原理和装置 接近光速运动的荷电粒子在磁场中改变运动 方向时放出的电磁辐射。它是1947年在 GE 公司 的 Schenectady 实验室里发现的，

11、当时它被认为 是一种妨碍得到高能量粒子的“祸害”。1965 年 发明了储存环，它由一系列二极磁铁（使电子作 圆周轨道运动）、 四极磁铁（使电子束聚焦）、 直线节和补充能量的高频腔组成，可以把电子束 （或正电子束）储存在环内长时期运行，于是在 每一个弯转磁铁处都会产生同步辐射，同步辐射 才开始走向实用。 ²在已解出的生物大分子结构数中，利用同步辐射技术解出的大于55%；每年解出物大分子晶体结构中，同步辐射解出的结构为60%100%；世界上现有同步辐射生物大分子实验线站有50余个；生物大分子实验线站在各国同步辐射实验室中均占重要地位，用户需求量大，成果比重大。而且通过对结构的动态研究可以

12、得出结构改变与功能实现方面的重要知识。而X射线单晶衍射方法也有缺点,就是样品但生物大分子结晶困难，特别膜蛋白和病毒等分子组装体结晶更是困难。次对于像病毒那样大的分子组装体，测量精细结构十分复杂. 原因有二：胞含有的原子极多，X射线衍射点极常常无法区分、辨认和探测；胞所产生的衍射点强度过弱，特别高分辨时，无法与背景区分。NMR也是测定生物大分子结构重要手段基本原理：核磁共振现象( nuclear magneticresonance spectroscopy ,NMR)1946 年由哈佛大学的伯塞( E.M.Purcell) 和斯坦福大学的布洛赫(F.Bloch) 所领导的2个小组,用不同的方法在

13、各自的实验室里观察到的,伯塞尔使用的实验方法是吸收法,而布洛赫使用的是感应法.核磁共振分析技术是利用物理原理,通过对核磁共振谱线特征参数的测定来分析物质的分子结构与性质.NMR 不破坏被测样品的内部结构,是一种无损检测方法.由于不同的原子核吸收不同的电磁波,因而通过测定和分析受测物质对电磁波的吸收情况就可以判定它含有哪种原子,原子之间的距离有多大,并据此分析出它的三维结构。以蛋白质为例,它的二级结构如螺旋,折叠、转角、环形和卷曲等,体现了蛋白分子主链原子在三维空间各种不同的排列规律性. 位于不同二级结构域的原子核间距,原子核间的相互作用以及多肽段的动特性,都直接反映蛋白质三维结构的特征.这些具

14、有不同结构特征的原子核间距、肽键二面角、肽键的动态特性等都具有特征的核磁共振谱线. 因此,我们分析核磁共振谱就可以获得蛋白质的三维结构.1H,13C,15N是核磁共振检测的主要对象,各不同的共振频率,从而形成核磁共振氢谱、碳谱和氮谱三部分.最初,核磁共振技术主要用于核物理研究方面,用它测量各种原子核的磁矩,误差仅是0. 003 %0. 005 %; 迄今,它已广泛应用于化学、食品、医学、生物学、遗传学等学科领域,已成为在这些领域开展研究工作的有力工具,甚至是某些领域(如:化学、医学诊断、药物学等) 常规分析中不可缺少的手段。1985 年,维特里希( Kurt Wüthrich）等人公

15、布了第一次利用NMR 法测定的溶液中蛋白酶抑制剂IIA ( proteinase inhibitor IIA) 的结构。1990 年用NMR 测定的蛋白质结构有23 个,而到1994 年一年测定的蛋白质结构数上升到100个。1997 年,维特里希应用NMR 方法测定的一种蛋白感染素(prion protein)的结构。²²核磁共振方法的最大特点是可以直接在溶液中定自然状态下的大分子三维空间结构,其分辨率已接近012nm ,但因为大分子量的生物分子的核磁共振图谱非常复杂,难以解释,因此它只能测量分子量较小(15-25kDa)的生物分子,至今最大可测定35kDa 的生物分子;其

16、次在测定中要求样品是高纯度且数量相对较多,使样品制备亦有困难;此外,核磁共振只能用于水溶液性的生物样品,对膜蛋白或病毒等的组装体、复合体就无法测定.²另一种方法称为冷冻电镜计算机三维重构方法或单颗粒技术. 这种技术特点是:急速冷冻(103 -104 Ps) 样品悬液,样品被包埋在无定形的非晶态冰薄膜中,这样既不损伤样品,又可使样品保持着自然状态,因而样品制备简单,缺点是分辨率稍低. 利用这种技术研究的病毒样品,目前分辨率接近0.17nm ,预计这几年内可达0.14nm. 核糖体可达1.10nm ,而离子通道可达2.10nm.²²²由于应用冷冻电镜与计算机重构技术研究维结构所需样品制备简单,对病毒的大小没有使其发展很快,至今已有100 多个病毒的三维结构被冷冻电镜计算机