苯酚-硫酸法定量测定桔梗多糖的研究

1、苯酚-硫酸法定量测定桔梗多糖的研究<                           作者：李妍 魏建和 许旭东 师凤华 褚庆龙【摘要】   目的建立桔梗多糖含量定量测定方法，为评价桔梗药材及新选育品种的质量提供方法。方法桔梗样品用水提取，经多级处理除去杂质制得桔梗精制多糖，精制多糖溶解与苯酚-硫酸试剂显色；用精制多糖

2、测得桔梗多糖与葡萄糖的换算因子，采用苯酚-硫酸比色法测定桔梗样品中多糖的含量。结果建立了一种苯酚-硫酸法测定桔梗多糖质量分数的方法，其平均回收率为97.54% ，RSD=1.44%。对不同来源桔梗中多糖的质量分数进行测定，其范围为8.54%20.28%。结论此方法简便可行，桔梗多糖供试液在4 h内显色稳定，重复性较好，可作为桔梗多糖的测定方法。 【关键词】   桔梗多糖； 苯酚-硫酸法； 定量测定Abstract：ObjectiveAn phenol-H2SO4 colorimetry method was developed for the determination of pol

3、ysaccharides in Radix platycodonis samples from different origins, in order to provide a scientific basis for a quality evaluation of breeding good Radix platycodonis.MethodsExtracted with water, removed the interference components during the pretreatment process, and a corrected factor was used in

4、order to minimize the error between glucose and polysaccharides of determination, the contents of the polysaccharides in Radix platycodonis samples were determined by phenol-H2SO4 colorimetry method.ResultsAn phenol-H2SO4 colorimetry method for determination of polysaccharides in Radix platycodonis

5、samples from different origins has been established. The average recovery rate for the polysaccharides was 97.54% with 1.44% of RSD (n=6). The content range of polysaccharides in Radix platycodonis from different origins was from 8.54% to 20.28%.ConclusionThis determination method is simple, practic

6、al, good reproducibile and the color of the treated samples can be stabilized within 4h.Key words：Radix platycodonis;   Polysaccharide;   Phenol-sulfuric acid colorimetry method    桔梗为桔梗科Campanulaceae植物桔梗Platycodon grandiflorum A DC.的根1，是一种药食同源的食品，用途广泛。桔梗多糖是一种菊糖型多聚

7、糖2，是桔梗食用品质的主要评价指标。 现代 药 理学 研究发现桔梗多糖还具有多种生物活性，如免疫调节、祛痰、保肝、消炎、改善胰岛素、增强机体免疫功能及抗肿瘤等，具有广阔的开发前景3，4。    本实验室于2001年启动了对桔梗的优良品种选育的系统研究，并于2004年首次发现了桔梗雄性不育种质，现已选育出不育率100%的桔梗细胞质雄性不育系、保持系、自交4代纯系，以及紫花、粉花、白花等一批纯合品系，其品质需要依据药用或食用育种目标进行评价5。以往对桔梗的研究主要侧重于桔梗中的皂苷类化学成分68，而忽视了桔梗中的多糖类成分及质量控制的研究。本文首次建立了 应用 紫外-

8、分光光度法测定桔梗中多糖含量的检测方法。现报道如下。1   仪器、试剂与材料 1.1   仪器UV-1102紫外分光光度计，上海天美 科学 仪器有限公司产品；TB-214 电子 天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；数显恒温水浴锅HH-6，国华电器有限公司产品；旋转蒸发仪R-205，BüCHI有限公司产品；台式高速离心机141，Thermo ELECTRON CORPORATION产品；电热恒温鼓风干燥箱DHG-9240，上海精宏实验设备有限公司产品；电冰箱BCD-233，伊莱克斯公司产品。1.2   试剂苯酚，北京化学试

9、剂公司产品；浓硫酸、无水乙醇、丙酮、乙醚、石油醚，以上试剂均为分析纯；蛋白酶，丹麦诺维信( 中国 )有限公司产品。1.3  材料桔梗样品共10个：GP1BC1-12和GP1BC2-6为3代不育株系；GSNH3-M3为2代粉花自交株系，种质来源于河北；GS902-7-2为3代自交保持株系，种质来源于安徽；GS218-1，GS218-2和GS228-1为2代自交系，种质来源于山东；GS111-2为2代自交株系，种质来源于赤峰；GS173-5为2代自交株系，来源于延庆野生种质；CK2为山东生产用种质9。以上各样品于2007-11初地上部分枯萎后，将其根部挖出，每个样品系内随机取3株，洗净，

10、趁鲜刮去外皮，烘箱中60 烘干，粉碎，粉末混合均匀后，装于自封袋中，置于干燥器中保存，备用。样品均采自药用植物研究所试验基地（北京市海淀区），由魏建和研究员鉴定。2   方法与结果 2.1  桔梗多糖的提取与精制 称取3种不同桔梗样品的粉末（已干燥）各l0 g，置索氏提取器中，加入石油醚(沸程6090 )100 ml，90 回流提取至无色，滤渣挥干；加80%的乙醇200 ml于90 水浴回流l h，提取2次，抽滤，挥干乙醇；滤渣加150 ml蒸馏水l00 水浴回流提取l h，过滤，滤渣重复提取两次。合并滤液冷却至室温后加入相当于桔梗质量02%的蛋白酶，55 酶解，

11、约2 h，加热至95 恒温30 s灭酶，冷却至室温，离心，取上清液浓缩至100 ml，然后用流动的自来水透析48 h，蒸馏水透析24 h，将透析液离心，除去沉淀，加无水乙醇，使乙醇体积分数达到70%，冰箱中静置过夜，离心(4 800 r/min，10min)，回收上清液，沉淀用无水乙醇，丙酮，乙醚各洗涤两次，于50 烘箱中烘干即得桔梗精制多糖。称重， 计算 桔梗精制多糖得率，备用。结果见表1。表1  桔梗精制多糖得率结果（略）GP代表桔梗不育系测交材料，GS代表桔梗自交系材料2.2  最大吸收波长的确定 精确称取50 干燥至恒重的桔梗精制多糖20 mg，置于100 ml容量

12、瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，按照“243”中所述方法与苯酚-硫酸试剂显色，以等量的蒸馏水作空白，紫外-可见光全波长扫描，测定桔梗精制多糖的最大吸收波长。按此方法，测定3种不同桔梗精制多糖的最大吸收波长平均值为486 nm。2.3  桔梗多糖最佳醇沉体积分数的确定 以GP1BC1-12为样品，精确称取5份桔梗粉末各3 g，按照“261”所述方法，制得桔梗多糖提取液，真空浓缩至30 ml，加入无水乙醇至乙醇的体积分数分别为40%，50%，60%，70%，80%，置于冰箱中静置过夜，离心(4 800 r/min，10 min)，回收上清液，收集沉淀，将沉淀置于50 烘箱中烘干至恒重，称量。测定桔梗多糖最佳醇沉体积分数为70%。2.4   标准曲线的绘制2.5  换算因子的测定  精确称取50 干燥至恒重的桔梗（GP1BC2-6, GP1BC1-12,GSNH3-M3）精制多糖20 mg，置于100 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制得桔梗多糖贮备液，苯酚-硫酸比色法测定其吸光度，由回归方程求出此精制桔梗多糖贮备液中葡萄糖质量浓度，按下式计算换算因子：    换算因子