大肠杆菌的测定(精)

1、水中总大肠杆菌的测定来源:加入时间：2010-3-30 12:15:511原理总大肠杆菌群可用多管发酵法或滤膜法检测。多管发酵法的原理是根据大肠菌 群细菌能发酵乳糖，产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽抱,呈杆状等有关特性, 通过三个步骤进行检验，求得水样中的总大肠菌群数，实验结果以最可能数（mostP robable number简称 MPN 表示。2仪器2.1高压蒸汽灭菌器。2.2恒温培养箱，冰箱。2.3生物显微镜，载玻片。2.4酒精灯，镍铬丝接种棒。2.5培养皿（直径100mm试管（5 >150mm,小倒管，吸管（1,5, 10ml，烧杯（200, 500, 2000ml ,锥形瓶

2、（500, 1000ml，采样瓶。3培养基及染色剂的制备3.1乳糖蛋白胨培养液:将10g蛋白胨、3g牛肉浸膏、3g乳糖和5g氯化钠加热溶于1000mL蒸馏水 中调节pH为7.2-7.4,再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL ,充分混匀，分装于试管 （内有倒管中,于121C高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。3.2三倍浓缩蛋白胨溶液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法制备。除蒸馏水外，各组分用量增加至三 倍。3.3品红亚硫酸钠培养基3.3.1贮备培养基的制备于2000mL烧杯中，先将20-30g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入 3.5g磷酸氢二钾及10g蛋白胨，混匀,使其溶

3、解，再用蒸馏水补充到1000mL调节溶液 pH至7.2-7.4。趁热用脱脂棉或绒布过 滤，再加10g乳糖，混匀，定量分装于250或 500mL锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在121E灭菌15min ,贮存与冷暗处备用。3.3.2平皿培养基的制备将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管 按1:50比例吸取5%碱性品红乙醇溶液,置于灭菌空试管中；再按1:200比例称取无 水亚硫酸钠，置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min （灭菌。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内 至深红色再褪至淡红色为止（不宜加多。将此混合液全

4、部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡。立即将此培养基适量（约15mL倾入已灭菌 的平皿内，再冷却凝固后置于冰箱内备用，但保存时间不宜超过2周。如培养基由淡 红色变成深红色则不能再用。3.4伊红美蓝培养基制备于2000mL烧杯中，先将20g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解,再加入2g磷 酸二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL ,调节溶液pH值至 7.2-7.4,趁热用脱脂棉或绒布过滤，加入2%伊红水溶液（0.4g伊红溶于20mL水中20ml和0.5%美蓝水溶液（0.065g美蓝溶于13mL水中13ml ,再加入10g乳糖,混匀后定量分装于250或50

5、0mL锥形瓶内，于121 E高压灭菌15min，放冷至45E左右,无菌操作下将此培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待冷却凝固后,置于冰箱内备 用。3.5革兰氏染色剂3.5.1结晶紫染色液：将20mL结晶紫乙醇饱和溶液（称取4-8g结晶紫溶于100mL95%乙醇中和80mL1%草酸铵溶液混合并 过滤。该溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。3.5.2助染剂:将1g碘与2g碘化钾混合后，加入少许蒸馏水,充分振荡,待完全溶解后，用蒸馏水补充至300mL。此溶液2周内有效。当溶液由棕黄色变为淡黄色时应弃去。为 易于贮备，可将上述碘与碘化钾溶于30mL蒸馏水中，临用前再加水稀释。3.5.3脱色剂:95%乙醇。

6、3.5.4复染剂:将 0.25g沙黄加到10mL95%乙醇中待完全溶解后，加90mL蒸馏水。4测定步骤4.1生活饮用水4.1.1初发酵实验:在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管,以无菌操作加入充分混匀的水样10mL ,混匀后置于37r 恒温箱内培养24h。4.1.2平板分离:上述各发酵管经培养24h后,将产酸，产气及只产酸的发酵管分 别接种于伊红美蓝 培养基或品红亚硫酸钠培养基上，置于37r培养箱内培养24h，挑 选符合下列特征的菌落。a.伊红美蓝培养基上：深紫黑色,具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光 泽的菌落：淡紫红色,中心色较深的菌落。b.

7、品红亚硫酸钠培养基上：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心颜色较深的菌落。4.1.3取有上述特特征的群落进行革兰氏染色a、用已培养18-24h的培养物涂片，涂层要溥。将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液,1min后用水洗去。滴加助染剂,1min后用水洗去。滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止（约20-30S用水洗去。滴加复染剂，1min后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红 色者为阴性菌。4、复发酵实验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽抱的杆菌，则挑选该 菌落的另一部分接种 于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管,每管可 接种分离自同一初发酵管（瓶的